本發明專利技術涉及使用膀胱癌特異性標記基因的用于診斷膀胱癌的試劑盒和核酸芯片。具體涉及用于診斷膀胱癌的試劑盒和核酸芯片，其可檢測膀胱癌特異性基因的啟動子甲基化，該啟動子或其外顯子區在膀胱癌的轉化細胞中被特異性甲基化。本發明專利技術的診斷試劑盒或者核酸芯片的使用能夠在轉化的早期診斷膀胱癌，由此能夠早期診斷膀胱癌，并且與常規方法相比可以更精確迅速的方式診斷膀胱癌。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及使用膀胱癌特異性標記基因的用于診斷膀胱癌的試劑盒和核酸芯片，具體涉及用于診斷膀胱癌的試劑盒和核酸芯片，其可檢測膀胱癌特異性基因的啟動子甲基化，該啟動子區在膀胱癌的轉化細胞中被特異性甲基化。
技術介紹
膀胱癌是泌尿系統最常見的癌癥，并由許多因素引起。已知膀胱癌主要由吸煙或者各種化學物質(皮革染料、空氣污染、人造增甜劑、硝酸鹽以及類似物)引起，這些化學物質在體內吸收后作為尿液排泄出來的同時刺激膀胱壁。作為診斷膀胱癌的常規方法，使用發現尿液中的異常細胞的方法，但是準確率很低。而且，包括將導管插入到膀胱中并從膀胱中收集可疑組織的細胞檢查是具有相當高的精確率的侵入方法(invasive method)。一般說來，當膀胱癌在早期被診斷時，膀胱癌患者的存活率增加，但在早期診斷膀胱癌是不容易的。作為用于診斷膀胱癌的方法，目前使用的是切除身體部分，但其在早期診斷膀胱癌分類是有難度的。根據浸潤到膀胱的肌肉層，膀胱癌被分為淺表性癌和浸潤性癌。一般說來，在膀胱癌診斷時大約30%的患者是浸潤型膀胱癌患者。因此，為了增加患者的存活時間，當膀胱癌病變很小時在早期診斷膀胱癌是最佳方法。因此，迫切需要開發比各種用于膀胱癌的現有診斷方法更為有效的診斷方法，也就是說，允許早期診斷膀胱癌的膀胱癌特異性生物標記物可處理大量的樣品并具有高度的靈敏性和特異性。近年來，通過DNA甲基化測定診斷癌癥的方法已經被提出。DNA甲基化主要出現在特定基因的啟動子區中的CpG島的胞嘧啶上以干擾轉錄因子的結合，由此使基因表達沉默。因此，檢測腫瘤抑制基因的啟動子中的CpG島的甲基化極大地有助于癌癥研究。近年來，已經嘗試通過諸如甲基化特異性PCR(這里稱為MSP)或者自動DNA測序來確定啟動子的甲基化來診斷并篩查癌癥。盡管關于啟動子CpG島的甲基化是否直接誘導癌癥形成或者在癌癥形成之后引起次級變化存在爭議，但業已發現在許多癌癥中腫瘤抑制基因、DNA修復基因、細胞循環調節基因以及家系(line)是超甲基化的，因此這些基因的表達被沉默。特別是，已知特定基因的啟動子區域的超甲基化在癌癥形成的早期階段出現。因此，腫瘤相關基因的啟動子甲基化的甲基化是癌癥的重要指標，并可在許多應用中使用，包括癌癥的診斷和早期診斷，癌癥發展的預測，癌癥的預后預測，治療后的進度檢查(follow-up examination)以及對抗癌治療響應的預測。近年來,檢查血液、痰、唾液、糞便中腫瘤相關基因的啟動子甲基化并使用檢查結果診斷和治療癌癥的實際嘗試已經活躍地進行(Esteller, Μ.等人，Cancer Res. , 59:67,1999 ；Sanchez-Cespedez, Μ.等人，Cancer Res. , 60:892, 2000 ；Ahlquist, D. A 等人，Gastroenterol. ,119:1219, 2000)。因此，本專利技術的專利技術人付出了極大的努力來開發能夠有效診斷膀胱癌的診斷試劑盒，結果發現膀胱癌可通過使用在膀胱癌細胞中特異性表達的甲基化相關基因的啟動子的生物標記物來測定甲基化程度進行診斷，由此完成了本專利技術。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供用于診斷膀胱癌的試劑盒，其包括甲基化的膀胱癌標記物基因的啟動子或者外顯子區域。本專利技術的另一目的在于提供用于診斷膀胱癌的核酸芯片，其包括能夠與含有膀胱癌特異性標記物基因的CpG島的片段雜交的探針。本專利技術的還一目的在于提供測定來自診斷樣品的基因的啟動子或外顯子的甲基 化的方法。為了實現上述目的，本專利技術提供了用于診斷膀胱癌的試劑盒，其包括選自下組的甲基化的膀胱癌標記物基因的啟動子或者外顯子，所述組由(1)CDX2(NM_001265)-尾同源異型盒轉錄因子2 ;(2)0￥ 181(匪_000104)-細胞色素？450，家族1，亞科B，多肽I ;(3)VSX1(NM_199425)_視覺系統同源異型盒I同系物(homoIog)，CHXlO-狀(斑馬魚)；(4)H0XA11(NM_005523)-同源異型盒All； (5)T(NM_003181)-T,鼠短尾突變體表型同系物(brachyury homolog)(小鼠)；(6) TBX5 (NM_080717)-T-盒 5 ； (7)PENK(NM_006211)-腦啡妝原(proenkephalin) ; (8) PAQR9 (NM_198504)-黃體酮(progestin)和 adipoQ 受體家族成員IV ;(9)LHX2(NM_004789)-UM同源異型盒2 ;以及(10) SM2 (U80456)-單意同源物2 (single-minded homolog) 2 (果蜆)所組成。本專利技術還提供了用于診斷膀胱癌的核酸芯片，其包括能夠與含有選自下組的膀胱癌標記物基因的啟動子或者外顯子的CpG島的片段雜交的探針，該組由(I)CDX2 (NM_001265)-尾同源異型盒轉錄因子 2; (2) CYPlBl (NM_000104)-細胞色素 P450，家族1，亞科B，多肽I ;(3)VSX1(NM_199425)_視覺系統同源異型盒I同系物(homoIog)，CHXlO-狀(斑馬魚)；(4)H0XA11(NM_005523)-同源異型盒 All ;(5)T(NM_003181)-T，鼠短尾突變體表型同系物(brachyury homolog)(小鼠);(6) TBX5 (NM_080717)-T-盒5 ； (7)PENK(NM_006211)-腦啡肽原(proenkephalin) ; (8) PAQR9 (NM_198504)-黃體酮(progestin)和 adipoQ 受體家族成員 IV ; (9) LHX2 (NM_004789)-UM 同源異型盒 2 ;以及(10)SIM2 (U80456)-單意同源物 2 (single-minded homog 2)(果蜆)所組成。本專利技術還涉及測定選自下組的來自診斷樣品的基因的啟動子或外顯子的甲基化的方法，該組由CDX2、CYPlBl、VSXl、H0XA11、T、TBX5、PENK, PAQR9、LHX2 和 SM2 所組成。通過下列詳細描述和隨附的權利要求書，本專利技術的其他特征和實施方式將更加容易想到。附圖說明圖I是通過CpG微陣列分析來自正常人和膀胱癌患者的尿液細胞中的用于膀胱癌診斷的甲基化生物標記物的過程的示意圖。圖2定量顯示了通過膀胱癌細胞系中的10種甲基化生物標記物的焦磷酸測序(Pyrosequencing)得到的甲基化程度。圖3顯示了在臨床樣品中10種生物標記物基因的甲基化指數的測定結果。圖3顯示了在正常人、膀胱炎患者、血尿癥患者和膀胱癌患者尿液細胞中10種生物標記物的甲基化程度的測定結果。圖4顯示了測定用于膀胱癌診斷的10種甲基化生物標記物中每種的靈敏性和特異性的受試者操作特征(ROC)曲線分析的結果。圖5顯示了正常人和膀胱癌患者尿液細胞中的甲基化頻率。圖6顯示了用于膀胱癌診斷的使用邏輯回歸分析(logistic regressionanalysis)從10種生物標記物中選擇的6種生物標記物基因的最佳組(optimal panel)的甲基化圖示，并顯示了用于膀胱癌診斷的基因組(gene panel)的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種診斷膀胱癌的試劑盒，其包括能夠擴增含有膀胱癌標記物基因SIM2？單意同源物2(果蠅)的CpG島的片段的引物。
【技術特征摘要】
...
【專利技術屬性】
技術研發人員：安成煥，文英豪，吳泰正，
申請(專利權)人：基因特力株式會社，
類型：發明
國別省市：
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