本發明專利技術公開了一種超級細菌NDM和KPC基因雙重熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒，利用特異性設計的引物和探針，優化擴增體系和條件，能在同一體系同時完成KPC和NDM兩個基因的檢測，較單重熒光定量PCR更加高效、省時省力，本方法特異性好、重復性佳、靈敏性高，且可以利用已建立的標準曲線對未知樣本進行定量分析。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及熒光定量PCR
，特別涉及檢測超級細菌耐藥基因的雙重熒光定量PCR技術及其試劑盒。
技術介紹
碳青霉烯是有著廣譜抗菌活性的一類β -內酰胺類抗生素，常作為治療高產Ampc和超廣譜的β_內酰胺酶的革蘭陰性桿菌引起的感染的最有效的藥物。但隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，細菌也逐漸獲得對此類藥物的耐藥性。近年來，耐碳青霉烯的非發酵菌已成為醫院感染的嚴重問題，而且耐碳青霉烯的腸桿菌細菌的報道也越來越多，這種耐碳青霉烯的革蘭陰性桿菌的快速傳播和流行正日益成為令人擔憂的全球性問題。細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥主要原因是產生碳青霉烯酶，其包括Ambler 分子分類的Α、B、D三類酶。其中A類中的新增成員KPC (Klebsiella PneumoniaeCarbapenemase)和 B 類中新增成員 NDM (New Delhi metallo-β-lactamase),因其能夠水解除頭霉素類以外幾乎所有的β_內酰胺類抗菌藥物而引起了世界各國抗感染專家和臨床微生物工作者的極大關注。攜帶有NDM或KPC基因的細菌也被稱為“超級細菌”。特別是攜帶有NDM的“超級細菌”目前僅對替加環素和黏菌素敏感，但是前者具有毒副作用，后者只能用于治療部分種類的細菌感染，一般不適合大規模使用而且對黏菌素耐藥的多重耐藥菌株目前已有報道。由NDM或KPC型的“超級細菌’感染造成的暴發流行，往往使治療陷入無藥可用的境地，給臨床抗感染治療帶來極大挑戰。因此及時檢測NDM和KPC基因，對細菌耐藥表型進行監測，控制和杜絕超級細菌的爆發流行顯得至關重要。目前主要利用分子生物學技術檢測攜帶NDM或KPC基因的超級細菌，PCR的方法更是被譽為檢測的“金標準”。但普通PCR容易產生非特異性擴增，甚至會因為操作的原因出現假陽性或假陰性，而且普通PCR的結果判斷需要對產物進行凝膠電泳分析，操作不夠簡化。目前尚缺乏一種靈敏度高、特異性好、操作簡便，且能對同時對KPC和NDM基因進行聯合檢測的方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的不足，提供一種超級細菌NDM和KPC基因雙重熒光定量PCR檢測方法。本專利技術所采取的技術方案是 一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟 (1)提取待檢樣本的DNA|旲板； (2)對DNA模板進行PCR擴增，所用引物和探針序列如下 NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I), NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),NDM 基因的探針 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3), KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4), KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5), KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCA TTCAAGG (SEQ ID NO. 6)； 所用探針標記的熒光基團互不相同； (3)結果分析反應結束，根據待測樣本的Ct值判斷其是否為NDM、KPC基因陽性。上述雙重熒光定量PCR擴增體系為10μ I的Premix Ex Taq (Probe qPCR)(2X)，10Mmol/L 的 NDM 和 KPC 上下游上下游引物各 O. 4μ1，5Mmol/L 的 NDM-probe 和KPC-probe 各 O. 2μ1，ROX Reference Dye II 0· 4μ1，待檢 DNA 模板或陽性對照 DNA 或陰性對照 μ ，加滅菌去離子水補足體積至20μ1。上述雙重熒光定量PCR反應條件為95°C預變性20s ;然后95°C 3s，60°C 30s，反應40個循環。上述探針標記熒光為J0E-ECLIPSE和FAM-ECLIPSE。所用熒光定量PCR儀為美國ABI 7500 FAST。一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測試劑盒，包括如下成分Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2X)、引物、探針、ROX Reference Dye II、陽性對照品、陰性對照品，其中引物和探針序列分別為 NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I), NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2), NDM 基因的探針 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3), KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4), KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5), KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)； 所用探針標記的熒光基團互不相同。上述陽性對照品為NDM和KPC基因陽性的DNA標本混合物，陰性對照品為滅菌去離子水。本專利技術的有益效果是 本專利技術方法能在同一體系同時完成KPC和NDM兩個基因的檢測，較單重熒光定量PCR更加高效、省時省力。本方法特異性好、重復性佳、靈敏性高，且可以利用已建立的標準曲線對未知樣本進行定量分析。附圖說明圖I為特異性實驗擴增曲線 圖2為敏感性實驗擴增曲線 圖3為重復性試驗擴增曲線 圖4為標準曲線 圖5為臨床標本擴增曲線圖。具體實施方式實施例I 超級細菌NDM和KPC基因雙重熒光定量PCR檢測方法的引物和Taqman探針的設計與合成 (I)引物和探針的設計方法 在GeneBank上下載NDM和KPC基因所有亞型的序列，到目前為止NDM共六個亞型NDM-I，NDM-2, NDM-3，NDM-4，NDM-5，NDM-6 對應的 GeneBank 序列號分別是 AB614355，JF703135，JQ734687，JQ348841，JN104597, JN967644 ;KPC 共 11 個亞型分別為 KPC-2，KPC-3，KPC-4, KPC-5, KPC-6, KPC-7，KPC-8，KPC-9，KPC-10, KPC-II, KPC-12, GeneBank 序列號依次是 AY034847，AF395881, FJ473382, EU400222, EU555534, EU729727, FJ234412, FJ624872,GQ140348，HM066995，HQ641421。利用 Beacon Designer 7 軟件分別針對 NDM 和 KPC 基因各亞型間保守的區域設計引物和探針，使引物或探針與模板的結合點避開突變區域。設計好的引物和探針通過01igo6. 44、DNAstar、Primer Premier5. 0等多種軟件進行評估，且所有 引物在NCBI數據庫(www. ncbi.nlm.nih本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：（1）提取待檢樣本的DNA模板；（2）對DNA模板進行PCR擴增，所用引物和探針序列如下：NDM基因上游引物NDM？F：TTGGCGATCTGGTTTTCC（SEQ？ID？NO.1），NDM基因下游引物NDM？R：GGTTGATCTCCTGCTTGA（SEQ？ID？NO.2），NDM基因的探針NDM？probe：TGGCAGCACACTTCCTATCTCG（SEQ？ID？NO.3），KPC基因上游引物KPC？F：CGCAACTGTAAGTTACCG（SEQ？ID？NO.4），KPC基因下游引物KPC？R：CATGCCTGTTGTCAGATA（SEQ？ID？NO.5），KPC基因的探針KPC？probe：CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG？（SEQ？ID？NO.6）；所用探針標記的熒光基團互不相同；（3）結果分析：反應結束，根據待測樣本的Ct值判斷其是否為NDM、KPC基因陽性。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：芮勇宇，鄭芬，孫靜靜，王前，
申請(專利權)人：南方醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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