生產喹啉酸的重組微生物及利用該微生物的喹啉酸生產方法技術

本發明專利技術涉及一種生產喹啉酸的重組微生物及利用該微生物生產喹啉酸的方法，所述重組微生物表達這樣的融合蛋白，其中L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶由接頭連接。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】生產喹啉酸的重組微生物及利用該微生物的喹啉酸生產方法
本專利技術涉及生產喹啉酸的重組微生物及利用該微生物生產喹啉酸的方法。
技術介紹
喹啉酸(quinolinicacid)也被稱為2,3-吡啶-二羧酸，在醫藥、農藥、染料等諸多領域中被用于化學合成物的前體。上述喹啉酸可以通過化學或生物合成方法制備。化學合成方法將來自石油的不可再生(non-renewable)材料作為原料使用，因此會受到環境問題和油價或石油提取單位成本的影響。作為生物合成方法的代表性的例子，公開了在下述大腸桿菌(E.coli)中生產喹啉酸的方法：在去除了喹啉酸磷酸核糖基轉移酶活性的大腸桿菌中，通過克隆具有編碼L-天冬氨酸氧化酶(NadB)和喹啉酸合成酶(NadA)的基因的不同拷貝數的質粒，使上述兩種基因的表達得到增強(Eur.J.Biochem.175,221-228(1988),DE3826041)。此時，產生的喹啉酸的濃度為500mg/L或以下的非常低的水平。生成如此低濃度的喹啉酸的第一個原因是NadR的轉錄抑制，其為編碼L-天冬氨酸氧化酶的nadB和編碼喹啉酸合成酶的nadA的與NAD相關的轉錄抑制子。第二個原因是NAD導致的L-天冬氨酸氧化酶——NadB蛋白質的反饋抑制。第三個原因是大腸桿菌中由碳源至L-天冬氨酸的生物合成途徑變弱。為了解決第一個原因，在韓國專利公報第10-2012-008267號中，使用了微生物菌株來將喹啉酸的產量提高到5.5g/L，其中將在轉錄階段受到抑制的喹啉酸生物合成基因L-天冬氨酸氧化酶(NadB)和喹啉酸合成酶(NadA)的啟動子區域替換為組成型啟動子(constitutivepromoter)，并增強了L-天冬氨酸生物合成路徑。通過生物合成方法由L-天冬氨酸合成喹啉酸的生物合成途徑如以下反應方案所示。1)L-天冬氨酸氧化酶(NadB)L-天冬氨酸+氧<＝>過氧化氫+α-亞氨基丁二酸+H+2)喹啉酸合成酶(NadA)α-亞氨基丁二酸+磷酸二羥丙酮<＝>喹啉酸+磷酸+2H2O上述喹啉酸生物合成途徑中的中間代謝產物α-亞氨基丁二酸是一種不穩定的物質，具有在細胞內由天然的脫氨基反應，轉化為草酰乙酸酯的特性(THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,Vol.257,No.2,IssueofJanuary25.pp.626-632,1982)。通常，當不穩定的中間代謝產物被用作基質時，如果上述基質與酶之間的碰撞頻率不高，則會生成大量的副產物。但是，目前為止還沒有為解決與喹啉酸的生產相關的上述問題而進行的嘗試。另一方面，將異種酶或蛋白質通過氨基酸接頭連接，使它們表達為一個蛋白質的融合蛋白技術，被用于各種目的，例如將表達量少的蛋白質與表達量多的蛋白質連接，從而增加上述蛋白質的表達量，或者制備成與標記(Tag)連接的融合蛋白，從而提高蛋白質的純化率等。已知接頭的設計對于制備融合蛋白是重要的。通常，多使用具有α-螺旋結構的螺旋形接頭或結構上具有柔性(flexibility)的柔性接頭，并且例如，根據想要實現的融合蛋白的特性，可通過組合上述兩種接頭設計和使用各種接頭(CancerRes2005；65:(16).August15,2005)。公開技術問題本專利技術人嘗試通過表達由不同類型的氨基酸接頭連接而成的NadB和NadA的融合蛋白，來解決由不穩定的代謝產物導致的反應降低，并發現與現有的生物學生產方法相比，通過表達所述融合蛋白能夠以高收率生產喹啉酸，從而完成本專利技術。技術方案本專利技術的目的是提供生產喹啉酸的重組微生物，其表達由接頭連接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。本專利技術的另一個目的是提供生產喹啉酸的方法，包括培養上述重組微生物的步驟和回收在上述培養過程中產生的喹啉酸的步驟。有益效果根據本專利技術，通過提供表達由接頭連接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的微生物，能夠將現有生物學生產工序中的α-亞氨基丁二酸的自然分解反應最小化，由此能夠以高產率生產喹啉酸。附圖說明圖1顯示了根據本專利技術一具體實施方案的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的結構。圖2顯示了pPro-NBA、pNBHL1A、pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A、pNBFL4A質粒的結構。圖3顯示了表達編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸轉氨酶的基因的質粒pCPA的結構。優選實施方案的詳述作為一個實施方案，本專利技術提供了生產喹啉酸的重組微生物，其表達由接頭連接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。上述L-天冬氨酸氧化酶(以下，稱為“NadB”)作為具有將L-天冬氨酸氧化為亞氨基丁二酸的活性的酶，可以具有由SEQIDNO.42表示的氨基酸序列或與之有高同源性的氨基酸序列。[L-天冬氨酸氧化酶的活性]L-天冬氨酸+延胡索酸<＝>α-亞氨基丁二酸+琥珀酸+H+，或者，L-天冬氨酸+氧<＝>過氧化氫+α-亞氨基丁二酸+H+編碼上述酶的基因nadB的序列可以從文獻(MolSystBiol.2006；2:2006.0007.Epub2006Feb21)中公開的大腸桿菌(Escherichiacoli)的基因組序列(gi:GI:89109380)或者例如美國國家生物技術信息中心(NCBI)及日本DNA數據庫(DDBJ)等數據庫中獲取。上述喹啉酸合成酶(以下，稱為“NadA”)作為具有從亞氨基丁二酸合成喹啉酸的活性的酶，可以具有由SEQIDNO.43表示的氨基酸序列或與之有高同源性的氨基酸序列。[喹啉酸合成酶的活性]α-亞氨基丁二酸+磷酸二羥丙酮<＝>喹啉酸+磷酸+2H2O編碼上述酶的基因nadA的序列可以從文獻(MolSystBiol.2006；2:2006.0007.Epub2006Feb21)中公開的大腸桿菌的基因組序列(gi:GI:89109380)或NCBI及DDBJ等數據庫中獲取。如果增強上述NadB和NadA的活性，則在細胞內作為喹啉酸前體的α-亞氨基丁二酸的蓄積與從α-亞氨基丁二酸至喹啉酸的生物合成增加，從而可以增加喹啉酸的生產量。但是，由于上述α-亞氨基丁二酸是不穩定的代謝物，盡管上述兩種酶(NadB及NadA)的活性和表達量增加，如果α-亞氨基丁二酸與NadA的接觸頻率不高，則會生成大量的副產物，由此無法像期待的那樣有效地生產喹啉酸。為了解決這個問題，本專利技術使NadB及NadA以通過接頭相互連接的融合蛋白的形式在菌株中得到表達，從而能夠以高收率生產喹啉酸。上述NadB及NadA可以具有分別由SEQIDNO.42和43表示的氨基酸序列，但根據微生物的種類或菌株，顯示上述活性的蛋白質的氨基酸序列可能存在差異，因此不限定于此。即，只要上述NadB及NadA是以通過接頭相互連接而制備的融合蛋白形式提供，從而有助于增加喹啉酸的產率，它們可以是在SEQIDNO.42和43的氨基酸序列的一個或多個位置上，具有由一個或多個氨基酸的替換、缺失、插入或添加等而變異的氨基酸序列的突變體或人工變異體。在本文中，“多個”可根據蛋白質的三維結本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種生產喹啉酸的重組微生物，其表達由接頭連接的L?天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.01.06 KR 10-2012-00018451.一種生產喹啉酸的重組微生物，其表達由接頭連接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白，其中所述接頭由5～30個氨基酸組成，并且所述微生物為大腸桿菌(E.coli)。2.根據權利要求1所述的重組微生物，其中所述L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶分別由SEQIDNO.42和SEQIDNO.43表示的氨基酸序列組成。3.根據權利要求1所述的重組微生物，其中所述接頭由LA(EAAAK)nAAA或L(GGGS)nAAA的氨基酸序列組成，其中每個n為1～5的整數。4.根據權利要求1所述的重組微生物，其中所述接頭由選自SEQIDNO.54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列組成。5.根據權利要求1所述的重組微生物，其中所述融合蛋白由選自SEQIDNO.47、48、49、50、51、52和53的氨基酸序列組成。6.根據權利要求1所述的重組微生物，其中喹啉酸磷酸核糖基轉移酶的活性與天然微生物中的內在活性相比被進一步弱化。7.根據權利要求6所述的重組微生物...

【專利技術屬性】
技術研發人員：申容旭，金素影，許仁庚，金朱恩，孫晟光，李在熙，李沚泫，金昌謙，
申請(專利權)人：CJ第一制糖株式會社，
類型：發明
國別省市：韓國;KR