一種銀杏葉提取物中有機酸含量測定方法技術

本發明專利技術公開了一種用于測定銀杏葉提取物中有機酸含量的方法。該方法包括下列內容：銀杏葉提取物樣本的前處理、供試品溶液的制備、高效液相色譜分析等步驟。本發明專利技術在銀杏葉提取物樣本前處理過程中，用含牛血清白蛋白的水溶液進行超聲提取，去除了原花青素的干擾；在供試品溶液的制備過程中，用含0.1％磷酸的水溶液進行制樣，去除了部分雜峰的干擾，大大改善了色譜峰的色譜行為和分離效果。經上述方法分析后，可獲得銀杏葉提取物有機酸圖譜，并可以同時定量莽草酸、沒食子酸、原兒茶酸、6-羥基犬尿喹啉酸、對羥基苯甲酸等五種有機酸成分的含量。

Method for determining organic acid content in Ginkgo Leaf Extract

The present invention discloses a method for determining organic acid content in Ginkgo leaf extract. The method includes the following steps: pretreatment of samples of Ginkgo biloba extract, preparation of solution for sample preparation, and HPLC analysis. The present invention in the treatment of Ginkgo biloba extract samples before process with aqueous solution of bovine serum albumin by ultrasonic extraction, eliminate interference of procyanidins; in the tested preparation process solution, were used for sample preparation of aqueous solution containing 0.1% phosphoric acid, removing the interference peaks, greatly improved the chromatographic behavior and separation effect of chromatographic peak. By the analysis of the method, can obtain Ginkgo biloba extract organic acid profiles, and can also quantitatively shikimic acid, gallic acid, protocatechuic acid, 6- hydroxy kynurenic acid, p-hydroxybenzoic acid and other five kinds of organic acids content.

【技術實現步驟摘要】
一種銀杏葉提取物中有機酸含量測定方法
本專利技術涉及一種用于銀杏葉提取物中有機酸含量的測定方法。
技術介紹
銀杏葉為銀杏科植物銀杏(GinkgobilobaL.)的干燥葉，味微苦，性平，具有益心、活血止痛、斂肺平喘、化濕止瀉的功效。銀杏葉提取物臨床上用于治療心腦血管疾病和神經系統疾病。銀杏葉提取物成分復雜，目前的質量控制指標僅有兩類成分：黃酮醇苷類和內酯類，兩者總含量為30％。另有7成成分未被列入質量標準中。已有文獻報道，銀杏葉提取物除了黃酮醇苷和內酯成分外，還含有原花青素、有機酸、雙黃酮、異黃酮等成分。因此，為了逐步增加銀杏葉提取物中的可測成分，逐步提高和完善銀杏葉提取物的質量標準，對除黃酮醇苷和內酯成分之外的其他成分進行研究，就顯得尤為重要。文獻“高效液相色譜法測定銀杏果中有機酸的含量”(分析科學學報,2011,27(3):336-338.)報道了白果中含有草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸，并用一種色譜條件同時測定了這7種小分子有機酸。色譜條件流動相為3％甲醇-0.01mol/LK2HPO4，即用到了緩沖鹽體系。本專利技術人團隊在研究中發現，雖然白果中含有上述7種小分子有機酸，但銀杏葉提取物中卻不含這些有機酸，但含有至少5種其他的有機酸類成分，包括莽草酸、沒食子酸、原兒茶酸、6-羥基犬尿喹啉酸(6-HKA)和對羥基苯甲酸。這些有機酸類成分均具有較好的生物活性：莽草酸具有抗炎鎮痛、抗腫瘤、抗血栓、抗HIV等作用，是合成抗禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒藥物“達菲”的重要原料；沒食子酸具有抗腫瘤、保肝、抗真菌感染等作用；原兒茶酸具有抗炎、保護神經細胞、抗病毒、促進干細胞增殖分化等多種功效；6-HKA是高效的谷氨酸受體拮抗劑，對神經興奮性損傷具有很好的保護作用；對羥基苯甲酸具有抗菌消炎的作用。在測定銀杏葉提取物中的有機酸含量時，發現干擾測定最主要的成分是原花青素。因此，準確測定有機酸含量的前提是對有機酸類成分進行純化。有機酸常用的純化方式有兩種，一是用堿水提取，提取液調酸性后用有機溶劑萃取；另一種是用陰離子交換樹脂進行純化。兩者方法都用到了腐蝕性溶劑或毒性溶劑，前者包括氫氧化鈉、乙酸乙酯，后者包括氫氧化鈉、甲醇等。并且這兩種方法都不能有效的去除銀杏葉提取物中的原花青素，并且有機酸也有損失。去除原花青素最佳的方法是用聚酰胺樹脂，可以完全吸附這類成分，但同時，也會損失部分有機酸，如6-羥基犬尿喹啉酸(6-HKA)。專利“一種天然6-羥基犬尿喹啉酸提取物的制備方法及其應用”(CN201410007590.0)說明了6-HKA必須要用含酸的70％乙醇才能將吸附在聚酰胺樹脂上的6-HKA完全洗脫下來，而此時，部分原花青素成分也會被洗脫下來，從而干擾測定。大孔樹脂純化法是一種常用的純化原花青素的方法，但原花青素的極性跨度很大，單體成分，如兒茶素微溶于冷水，而高聚體原花青素，易溶于冷水，并且原花青素的聚合度越高，極性越大，因此大孔樹脂可以用于吸附原花青素，但極性較大的高聚體原花青素和有機酸成分用水或低濃度乙醇水溶液就可以洗脫下來，仍然無法完全去除干擾。綜上所述，準確測定銀杏葉提取物中的有機酸含量對于控制銀杏葉提取物的質量，提高銀杏葉提取物的標準，有著重大的意義；而找到一種去除原花青素，準確測定銀杏葉提取物中有機酸的方法是目前醫藥行業人員極為關心的問題。
技術實現思路
本專利技術提供了一種銀杏葉提取物中有機酸含量測定方法，目的在于能夠定量測定銀杏葉提取物中有機酸的含量，以達到銀杏葉提取物的質量更加可控的目標。本專利技術所采用的技術方案具體如下：一種銀杏葉提取物中有機酸含量測定方法，包括如下步驟：(1)銀杏葉提取物的前處理方法：取銀杏葉提取物，用含牛血清白蛋白的水溶液超聲提取，過濾；濾液濃縮干燥，得有機酸提取物；(2)供試品溶液的制備：有機酸提取物用含0.05～0.4％磷酸的水溶液溶解定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得；(3)對照品溶液的制備：精密稱取莽草酸、沒食子酸、原兒茶酸、6-羥基犬尿喹啉酸、對羥基苯甲酸的標準品適量，用流動相(乙腈:0.1％磷酸水溶液(V/V)：3.5:96.5)溶解，即得；(4)高效液相色譜分析：分別吸取供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀，按如下色譜條件測定，得五種有機酸的對照品色譜圖和供試品的色譜圖；色譜條件為：固定相是以辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為乙腈，流動相B為0.1％磷酸水溶液；紫外檢測器，檢測波長0～6min為215nm，6～25min為254nm；柱溫為30℃；進樣量為10ul；流速為1.0ml/min；采用等度洗脫，流動相A的體積分數為3.5％，流動相B的體積分數為96.5％。本專利技術制備方法中：步驟1)中，銀杏葉提取物的前處理方法為，取銀杏葉提取物100mg，用含0.1～10g/L牛血清白蛋白的水溶液5～100ml，20～70℃超聲提取5min～3h，過濾；濾液濃縮干燥，得有機酸提取物。步驟1)中銀杏葉提取物最佳前處理方法優選為，取銀杏葉提取物100mg，用含1g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃超聲提取1h，過濾；濾液濃縮干燥，得有機酸提取物。步驟2)中供試品溶液的制備方法優選為，有機酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，搖勻，濾過，取續濾液，即得。本專利技術提供的一種銀杏葉提取物中有機酸含量測定方法，具有如下優勢：1.本專利技術與常用的純化有機酸的方法相比，未用到強腐蝕性和毒性的溶劑，整個前處理過程只用乙醇和水，環保無污染。2.本專利技術用牛血清白蛋白來去除原花青素，用含磷酸的水溶液來制樣，充分去除了干擾有機酸主峰色譜行為的雜質，大大改善了色譜峰的色譜行為和分離效果，從而達到了準確定量有機酸的目的。3.本專利技術測定方法使用的色譜條件中的流動相為乙腈:0.1％磷酸水溶液(V/V)：3.5:96.5，未用到緩沖鹽體系，更有利于色譜柱的平衡、后處理和保存。附圖說明：圖1為混合對照品色譜圖，1號峰為莽草酸、2號峰為沒食子酸、3號峰為原兒茶酸、4號峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號峰為對羥基苯甲酸圖2為純化方法1(本專利技術方法)制備的樣本色譜圖，1號峰為莽草酸、2號峰為沒食子酸、3號峰為原兒茶酸、4號峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號峰為對羥基苯甲酸圖3為純化方法2制備的樣本色譜圖，1號峰為莽草酸、2號峰為沒食子酸、3號峰為原兒茶酸、4號峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號峰為對羥基苯甲酸圖4為純化方法3制備的樣本色譜圖，1號峰為莽草酸、2號峰為沒食子酸、3號峰為原兒茶酸、4號峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號峰為對羥基苯甲酸圖5為不用牛血清白蛋白前處理的樣本色譜圖，1號峰為莽草酸、2號峰為沒食子酸、3號峰為原兒茶酸、4號峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號峰為對羥基苯甲酸圖6為用0.3g/L牛血清白蛋白前處理的樣本色譜圖，1號峰為莽草酸、2號峰為沒食子酸、3號峰為原兒茶酸、4號峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號峰為對羥基苯甲酸圖7為用70％甲醇制樣樣本的色譜圖，1號峰為莽草酸、2號峰為沒食子酸、3號峰為原兒茶酸、4號峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號峰為對羥基苯甲酸圖8為用含0.05％磷酸的水溶液制樣樣本的色譜圖，1號峰為莽草酸、2號峰為沒食子酸、3號峰為原兒茶酸、4號峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種銀杏葉提取物的含量測定方法，包括如下步驟：(1)銀杏葉提取物的前處理方法：取銀杏葉提取物，用含牛血清白蛋白的水溶液超聲提取，過濾；濾液濃縮干燥，得有機酸提取物；(2)供試品溶液的制備：有機酸提取物用含0.05～0.4％磷酸的水溶液溶解定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得；(3)對照品溶液的制備：精密稱取莽草酸、沒食子酸、原兒茶酸、6?羥基犬尿喹啉酸、對羥基苯甲酸的標準品適量，用流動相溶解，即得；(4)高效液相色譜分析：分別吸取供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀，按如下色譜條件測定，得五種有機酸的對照品色譜圖和供試品的色譜圖；色譜條件為：固定相是以辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為乙腈，流動相B為0.1％磷酸水溶液；紫外檢測器，檢測波長0～6min為215nm，6～25min為254nm；柱溫為30℃；進樣量為10ul；流速為1.0ml/min；采用等度洗脫，流動相A的體積分數為3.5％，流動相B的體積分數為96.5％。

【技術特征摘要】
1.一種銀杏葉提取物的含量測定方法，包括如下步驟：(1)銀杏葉提取物的前處理方法：取銀杏葉提取物，用含牛血清白蛋白的水溶液超聲提取，過濾；濾液濃縮干燥，得有機酸提取物；(2)供試品溶液的制備：有機酸提取物用含0.05～0.4％磷酸的水溶液溶解定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得；(3)對照品溶液的制備：精密稱取莽草酸、沒食子酸、原兒茶酸、6-羥基犬尿喹啉酸、對羥基苯甲酸的標準品適量，用流動相溶解，即得；(4)高效液相色譜分析：分別吸取供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀，按如下色譜條件測定，得五種有機酸的對照品色譜圖和供試品的色譜圖；色譜條件為：固定相是以辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為乙腈，流動相B為0.1％磷酸水溶液；紫外檢測器，檢測波長0～6min為215nm，6～25min為254nm；柱溫為30℃；進樣量為10ul；流速為1.0ml/min；采用等...

【專利技術屬性】
技術研發人員：喬洪翔，劉華春，任紅，蔣春，黃海波，陳君，陳岑，孔瓊榮，王蓮，王如偉，
申請(專利權)人：云南康恩貝植物研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：云南,53