一種測定自由巰基含量的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種測定自由巰基含量的方法，所述方法包括以下步驟：將供試品溶液進樣至高效液相色譜儀中進行色譜分離，而后經(jīng)過衍生儀時在衍生試劑的作用下進行衍生，由紫外檢測器采集液相色譜數(shù)據(jù)；利用已知自由巰基濃度的對照品溶液作為對照；通過供試品溶液的液相色譜峰面積與已知自由巰基濃度的對照品溶液的液相色譜峰面積的比較，計算得到供試品中自由巰基的含量。本發(fā)明專利技術(shù)的方法具有專屬性好，靈敏度高的特點，可以最大限度地免受其他物質(zhì)信號的干擾，測定結(jié)果準確度高，數(shù)據(jù)可靠。

Method for determining free sulfhydryl content

The present invention provides a method for the determination of free sulfhydryl content, the method comprises the following steps: for chromatographic separation of sample solution into the sample to high performance liquid chromatography, and then through the derivative instrument in the derivatization reagent under the action of derivatives, by UV detector liquid chromatography data acquisition; as compared with the control the solution of known concentration of free sulfhydryl groups; comparison of peak area of referencesolution peak area and the concentration of free sulfhydryl groups known by the testsolution liquid chromatography liquid chromatography, calculated the tested content of free sulfhydryl products. The method of the invention has the advantages of good specificity and high sensitivity, and the interference of other substance signals can be avoided to the maximum extent, the accuracy of the measurement result is high, and the data is reliable.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種測定自由巰基含量的方法
本專利技術(shù)屬于化學(xué)分析
，涉及一種測定自由巰基含量的方法。
技術(shù)介紹
自由巰基含量的測定方法有毛細管電泳法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，也可采用紫外-可見光譜法或者熒光光譜法。然而，毛細管電泳法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，紫外光譜法的靈敏度和準確度比較低，但是這種方法簡單、快速，并且反應(yīng)條件溫和，且可以同時測定總的自由巰基而被大家廣泛采用。其中Ellman試劑應(yīng)用最為廣泛，中國藥典里面收載的蛋白質(zhì)中自由巰基的含量測定方法即采用該法。但當該方法測定自由巰基的殘留時，即測定某種物質(zhì)中自由巰基的痕量時，該方法就存在靈敏度太低的問題。而在某些反應(yīng)中，尤其該物質(zhì)作為起始物料或中間物質(zhì)時，由于多余自由巰基物質(zhì)，如二巰基聚乙二醇，二硫蘇糖醇等，需要嚴格控制其殘留。CN102759586A公開了高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法，在該方法中利用甲酸作為巰基化合物的穩(wěn)定劑，流動相為含有甲酸的水相與有機相的混合物，可以明顯解決或減緩巰基化合物在供試液和流動相中因極端不穩(wěn)定現(xiàn)象而造成的含量測定誤差，然而其并不能提高檢測的靈敏度，并不能準確檢測殘留的痕量自由巰基的含量。因此，在本領(lǐng)域，急需開發(fā)一種高靈敏度，且專屬性好的方法來測定樣品中的自由巰基含量。
技術(shù)實現(xiàn)思路
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)的目的在于提供一種測定自由巰基含量的方法，本專利技術(shù)方法具有專屬性好，靈敏度高的特點，可以最大限度地免受其他物質(zhì)信號的干擾，測定結(jié)果準確度高，數(shù)據(jù)可靠。為達到此專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：一方面，本專利技術(shù)提供一種測定自由巰基含量的方法，所述方法包括以下步驟：(1)將供試品溶液進樣至高效液相色譜儀中進行色譜分離，經(jīng)過衍生儀時在衍生試劑的作用下進行衍生，由紫外檢測器采集液相色譜數(shù)據(jù)；(2)利用已知自由巰基濃度的對照品溶液經(jīng)過與步驟(1)所述供試品溶液相同的處理，得到對照品溶液的液相色譜數(shù)據(jù)；(3)通過供試品溶液的液相色譜峰面積與對照品溶液的液相色譜峰面積的比較，計算得到供試品中自由巰基的含量。在本專利技術(shù)中，通過利用高效液相色譜法并使用衍生劑使得可以大大提高檢測的靈敏度，以解決目前測定自由巰基方法中存在的其它物質(zhì)干擾大，靈敏度差的問題。優(yōu)選地，步驟(1)所述供試品為需要測定自由巰基含量的樣品。優(yōu)選地，所述含有自由巰基的物質(zhì)為二巰基聚乙二醇、二硫蘇糖醇、半胱氨酸或2-巰基乙醇中的任意一種或至少兩種的混合物。在本專利技術(shù)中，所述含有自由巰基的物質(zhì)不限于如上列舉的具體物質(zhì)，其他含有自由巰基的化合物或混合物均可以利用本專利技術(shù)的方法實現(xiàn)精確的測定。利用本專利技術(shù)所述的方法可以完成樣品中殘留自由巰基的檢測，例如本專利技術(shù)可以實現(xiàn)交聯(lián)玻璃酸鈉中二巰基聚乙二醇的殘留的定量檢測。在本專利技術(shù)中，所述色譜分離時的流動相可以為一切可以溶解供試品并通過HPLC進行測定的溶劑或溶劑混合物。優(yōu)選地，步驟(1)所述色譜分離時的流動相為醇類、乙腈或水中的任意一種或至少兩種的混合物。優(yōu)選地，步驟(1)所述色譜分離時的流動相為5％～95％(例如5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)乙腈，優(yōu)選60-80％的乙腈。優(yōu)選地，步驟(1)所述色譜分離時使用的色譜柱為含有長鏈烷基鍵合相的色譜柱或其相關(guān)色譜柱，優(yōu)選C18柱；柱溫為4～50℃(例如4℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃)，優(yōu)選30～50℃。優(yōu)選地，步驟(1)所述色譜分離時樣品流速為0.1～5mL/min，例如0.1mL/min、0.3mL/min、0.5mL/min、0.8mL/min、1mL/min、1.3mL/min、1.5mL/min、1.8mL/min、2mL/min、2.5mL/min、2.8mL/min、3mL/min、3.5mL/min、4mL/min、4.5mL/min或5mL/min。優(yōu)選地，步驟(1)所述衍生劑為5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DNTB)的磷酸鈉-EDTA(乙二胺四乙酸)緩沖液。優(yōu)選地，所述衍生劑中5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的濃度為0.01～100mg/100mL，例如0.01mg/100mL、0.05mg/100mL、1mg/100mL、3mg/100mL、5mg/100mL、8mg/100mL、10mg/100mL、15mg/100mL、20mg/100mL、30mg/100mL、40mg/100mL、50mg/100mL、60mg/100mL、70mg/100mL、80mg/100mL、90mg/100mL或100mg/100mL，優(yōu)選0.05～20mg/100mL。在本專利技術(shù)中，如果衍生劑中5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的濃度過低則衍生不夠完全，如果濃度過高，則干擾較大，均會影響到結(jié)果的準確性。優(yōu)選地，所述衍生劑中磷酸鈉的濃度為0.01～1mol/L，例如0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L、0.07mol/L、0.09mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L或1mol/L，優(yōu)選0.05～0.5mol/L。在本專利技術(shù)中，磷酸鈉的濃度太低則緩沖效果差，在測定自由巰基含量較高的樣品時影響衍生效果，濃度太高，則會由于緩沖液中離子濃度過高，從而影響衍生后數(shù)據(jù)采集時基線的平穩(wěn)，影響檢測方法的靈敏度。優(yōu)選地，所述衍生劑中磷酸鈉緩沖液的pH值為6～12，例如6、6.3、6.5、6.8、7、7.3、7.5、7.8、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5或12，優(yōu)選7～10。優(yōu)選地，所述衍生儀的衍生管的長度為0.2～50m，例如0.2m、0.5m、1m、3m、5m、8m、10m、15m、20m、25m、30m、35m、40m、45m或50m。衍生管長度太短會導(dǎo)致樣品通過衍生管時時間太短，衍生不完全，導(dǎo)致檢測結(jié)果比真實值偏低；衍生管長度太長，衍生完成的樣品通過衍生管的時間就會比較長，擴散效應(yīng)明顯，從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)采集時色譜峰不明顯，影響檢測的靈敏度。優(yōu)選地，所述衍生儀的衍生溫度為20～100℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃。優(yōu)選地，所述衍生儀中衍生試劑的流速為0.1～5mL/min，例如0.1mL/min、0.3mL/min、0.5mL/min、0.8mL/min、1mL/min、1.3mL/min、1.5mL/min、1.8mL/min、2mL/min、2.5mL/min、2.8mL/min、3mL/min、3.5mL/min、4mL/min、4.5mL/min或5mL/min。優(yōu)選地，所述紫外檢測器采集液相色譜數(shù)據(jù)為采集檢測波長為380～450nm的數(shù)據(jù)。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)具有以下有益效果：本專利技術(shù)的方法對于樣品中自由巰基含量的測定具有專屬性好，靈敏度高的特點，可以最大限度地免受其他物質(zhì)信號的干擾，該方法檢測限為1μg/mL，定量限為4μg/mL，準確度本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種測定供試品中自由巰基的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：(1)將供試品溶液進樣至高效液相色譜儀中進行色譜分離，經(jīng)過衍生儀時在衍生試劑的作用下進行衍生，由紫外檢測器采集液相色譜數(shù)據(jù)；(2)利用已知自由巰基濃度的對照品溶液經(jīng)過與步驟(1)所述供試品溶液相同的處理，得到對照品溶液的液相色譜數(shù)據(jù)；(3)通過供試品溶液的液相色譜峰面積與對照品溶液的液相色譜峰面積的比較，計算得到供試品中自由巰基的含量。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種測定供試品中自由巰基的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：(1)將供試品溶液進樣至高效液相色譜儀中進行色譜分離，經(jīng)過衍生儀時在衍生試劑的作用下進行衍生，由紫外檢測器采集液相色譜數(shù)據(jù)；(2)利用已知自由巰基濃度的對照品溶液經(jīng)過與步驟(1)所述供試品溶液相同的處理，得到對照品溶液的液相色譜數(shù)據(jù)；(3)通過供試品溶液的液相色譜峰面積與對照品溶液的液相色譜峰面積的比較，計算得到供試品中自由巰基的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述供試品為含有自由巰基的物質(zhì)的樣品。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述含有自由巰基的物質(zhì)為二巰基聚乙二醇、二硫蘇糖醇、半胱氨酸或2-巰基乙醇中的任意一種或至少兩種的混合物。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述色譜分離時的流動相為醇類、乙腈或水中的任意一種或至少兩種的混合物；優(yōu)選地，步驟(1)所述色譜分離時的流動相為5％～95％乙腈，優(yōu)選60-80％乙腈。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述色譜分離時使用的色譜柱為含有長鏈烷基鍵合相...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張兆利，鄭琳松，劉珊，
申請(專利權(quán))人：上海景峰制藥有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海,31