防治植物病害的生防菌株G68及其菌劑制備方法和應用技術

本發明專利技術公開了防治植物病害的生防菌及其菌劑制備方法和應用。該生防菌命名為Bacillus?subtilisG68，保藏號CGMCC?NO.8978；該生防菌菌劑的制備方法為將活化后的菌株G68接種于NYBE培養液培養22～26h獲得種子液，將種子液接種于含0.08～0.12mMMnSO4的NYBE發酵培養基培養70～74h獲得發酵液，即為生防菌菌劑；含菌株G68的生防菌劑可促進植物種子萌發，加速植物生長，且對番茄立枯病和早疫病病害防效分別達53.8%和60.1%；菌株G68具有抗菌譜廣，效果穩定，制備成本低，應用方法簡單，環境友好，無毒害等特點，在植物病害防治方面具有很好的應用前景。

【技術實現步驟摘要】
防治植物病害的生防菌株G68及其菌劑制備方法和應用
本專利技術屬于農業生物
，具體涉及防治植物病害的生防菌及其菌劑制備方法和應用。
技術介紹
我國作為一個農業大國，農作物的病害防治問題在農業種植中相當重要。據報道，我國糧食作物每年因病害問題造成的損失至少有10%~15%。農作物病害的發生往往使國家經濟和人民生活遭受嚴重損失。植物病害防治的方法有植物檢疫、抗病育種、農業防治、化學防治、物理和機械防治和生物防治等。選育和利用抗病育種的方法是防治病害發生的有效途徑。然而，抗病品種在大面積推廣后容易在幾年內失去其抗病性而成為感染品種。化學防治因其生產簡便、價格便宜、特別是見效快等優點，在植物病害的防治中一直占有主要地位，而被廣泛應用。但使用不當，則會引起植物藥害，殺害有益微生物，導致病原菌產生抗藥性，高濃度的農藥殘留還會發生人、畜中毒，環境污染等問題。生物防治的研究從20世紀30年代開始。生物防治具有許多優于化學防治的特點，其只針對病原微生物，不會殺死有益微生物，而且對人、畜安全，不會造成環境污染。因此，生物防治正成為植物病害防治的重要方法，國內外對生物防治的研究越來越多，該防治方法具有廣闊的應用前景。芽孢桿菌(Bacillus)是一種嗜溫、好氧、產芽孢的桿狀細菌，其生理特征多樣，分布廣泛，極易分離培養。該菌在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無害，不污染環境，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。用芽孢桿菌制備生防制劑防治植物病害的研究成為國內外研究的熱點。然而不同菌株的抑菌譜、抑菌作用、抑菌機理以及抑菌效果的穩定性等亦有較大差異。因此，篩選高效、廣譜、效果穩定的芽孢桿菌仍是生物防治的一個研究熱點。
技術實現思路
為了解決上述問題，針對目前農業生產植物病害防治中大量使用化學殺菌劑，造成農藥殘留、環境污染等問題，本專利技術提供了一種高效、廣譜、效果穩定及環境友好的植物病害生防菌菌株G68。本專利技術的目的在于提供一株新菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）G68。本專利技術的另一個目的在于提供上述菌株在植物病害防治過程中的應用。本專利技術的再一個目的在于提供一種含有BacillussubtilisG68的植物病害防治劑。本專利技術的再一個目的在于提供生防菌株BacillussubtilisG68菌劑的制備方法。本專利技術所采取的技術方案是：一種植物病害生防菌株G68，經鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，2014年3月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNO.8978，建議的分類命名為Bacillussubtilis，已于2014年3月28日鑒定保藏的菌株是存活的。上述生防菌株BacillussubtilisG68在植物病害防治過程中的應用。進一步的，上述的植物病害為植物細菌或真菌病害。一種植物病害防治劑，其含有上述植物病害生防菌株BacillussubtilisG68。生防菌株BacillussubtilisG68菌劑的制備方法，包括以下步驟：將權利要求1所述的生防菌株G68接種于LB平板在29～31℃條件下活化，將活化后的生防菌株G68接種于NYBE培養液，29～31℃，105～115r/min條件下培養22～26h，獲得種子液；將種子液按2.5～3.5%的接種量接種于含0.08～0.12mMMnSO4的NYBE發酵培養基，36～38℃，190～210r/min條件下培養70～74h，獲得發酵液，即生防菌株BacillussubtilisG68菌劑。本專利技術的有益效果是：1）本專利技術的生防菌劑制備過程簡單，成本較低，可替代或減少對化學農藥的應用，減少農藥殘留，降低農民農業生產成本。該菌劑為生物產品，無毒害，無環境污染，有利于無公害作物的生產及農業的可持續發展。2）本專利技術的生防菌株G68在試驗室平板拮抗試驗中表明：生防菌株G68可對番茄立枯病、番茄早疫病、小麥赤霉病、玉米炭疽病、冬瓜枯萎病、甘蔗黑腐病、棉花黃萎病、油菜菌核病等多種植物真菌和番茄青枯病等植物細菌病原菌均表現出良好的抑制效果，具有較廣的抗菌譜。并且經多次傳代培養，該菌株抗病效果穩定。3）本專利技術的生防菌株G68在溫室試驗結果中表明：含本專利技術所述生防菌株G68的生防菌劑可以促進種子萌發及作物生長，且該生防菌劑有效抑制了病原菌的生長，對于番茄立枯病（Rhizoctoniasolani）和早疫病（Alternariatomatophila）病害均表現出顯著的防治效果，防效分別可達53.8%和60.1%。附圖說明圖1為生防菌株G68抑制番茄立枯病病原菌（Rhizoctoniasolani）平板拮抗試驗；圖2為生防菌株G68抑制番茄早疫病病原菌（Alternariatomatophila）平板拮抗試驗。具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術作進一步的說明，但并不局限于此。實施例1一、生防菌株G68的分離、篩選和鑒定一種植物病害生防菌株G68，命名為BacillussubtilisG68，由廣東省農業科學院農業資源與環境研究所有機固體廢棄物處理基地的堆肥中分離得到。其具體分離、篩選、鑒定方法如下：（1）生防菌株G68的分離稱取10.0g混合均勻的堆肥樣品，加入90ml無菌水，30℃，180r/min，振蕩30min，將菌液依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，吸取適當的稀釋菌懸液（稀釋10-5、10-6、10-7倍的菌液）100μl均勻涂布在營養瓊脂平板上，每個稀釋度重復三次，于30℃恒溫培養箱中培養1~2d。按照細菌形狀、大小、色澤等生理性狀的不同，挑取單菌落再涂平板直到獲得單一形態的菌株，最后通過鏡檢，進一步觀察其形態，確為單一形態即為純化，純化后4℃冷藏備用。（2）生防菌株G68的篩選采用平板拮抗試驗方法進行生防菌株的篩選，吸取濃度為1×105CFU/ml的病原菌菌液100μl分別放入LB培養基（細菌）或PDA培養基（真菌）平板中涂布均勻，利用無菌打孔器在平板上打4個孔，每孔中分別注入在30℃培養24h的不同分離菌株的培養液、發酵上清液（6000r/min離心30min去除菌體）、無菌水及1mM的放線菌酮80μl，每個處理重復三次。30℃恒溫培養箱中培養3~5d后，觀察有無抑菌圈，計算抑菌活性。抑菌活性用抑菌圈直徑表示:抑菌圈直徑=透明圈直徑-孔徑(8mm)。將具有抑菌活性的菌株在LB平板上連續轉接培養10次(每隔7d一次)，測定每次傳代培養菌株的拮抗穩定性。根據對植物病原菌番茄立枯病、番茄早疫病、番茄青枯病、小麥赤霉病、玉米炭疽病、冬瓜枯萎病、甘蔗黑腐病、棉花黃萎病、油菜菌核病等的抑菌活性以及傳代后抑菌活性的穩定性，篩選出一株高效、廣譜、效果穩定的抗植物真菌和細菌病原菌的菌株，將菌株純化后，用50%的甘油保存于~70℃超低溫冰箱。生防菌株G68的鑒定經形態、染色、生理生化反應及分子生物學鑒定為Bacillussubtilis。a.生防菌株G68的菌落形態及菌體特征在LB固體培養基上菌落形態較小、邊緣不整齊、表面無凸起、較濕潤、不透明，呈乳白色。菌體細胞呈短桿狀、染色均勻，革本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種防治植物病害的生防菌株Bacillus?subtilis?G68，保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，其保藏號為CGMCC?NO.8978。

【技術特征摘要】
1.一種防治植物病害的生防菌株枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）G68，保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，其保藏號為CGMCCNO.8978。2.權利要求1所述的生防菌株枯草芽孢桿菌G68在植物病害防治過程中的應用；所述的植物病害為植物細菌或真菌病害；所述植物真菌病害為番茄立枯病菌、番茄早疫病菌、小麥赤霉病菌、玉米炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、甘蔗黑腐病菌、棉花黃萎病菌、油菜菌核病菌，所述植物細菌病害為番茄青枯病菌。3.一種植物病害防治劑，其特征在于：所述防治劑中含有權利要求1所述的生防菌株枯草芽孢桿菌G68。4.權利要求1所述的生防菌株枯草芽孢桿菌G68的菌劑的制備方法，其特...

【專利技術屬性】
技術研發人員：顧文杰，
申請(專利權)人：廣東省農業科學院農業資源與環境研究所，
類型：發明
國別省市：廣東;44