一種空腸彎曲菌快速檢測試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種用于快速檢測空腸彎曲菌DNA存在的熒光定量PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）檢測試劑盒，適用于定性或定量檢測空腸彎曲菌DNA的存在；空腸彎曲菌熒光定量PCR檢測試劑盒包括：DNA提取液，PCR反應(yīng)預(yù)混液，熱啟動(dòng)Taq酶，陽性標(biāo)準(zhǔn)品，陰性質(zhì)控品；與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法和生化鑒定相比，本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快且通量高的空腸彎曲菌熒光定量PCR檢測試劑盒，具有更加省時(shí)、操作簡便和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種空腸彎曲菌快速檢測試劑盒
本專利技術(shù)涉及一種用于快速檢測空腸彎曲菌DNA存在的熒光定量PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測試劑盒，適用于定性或定量檢測空腸彎曲菌DNA的存在。
技術(shù)介紹
空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是引起胃腸道感染細(xì)菌性腸炎最常見的食源性病原體之一，是一種螺旋狀、多形態(tài)性、微需氧的革蘭陰性菌，為常見的人獸共患病原菌，多數(shù)家禽、家畜攜帶此菌，在其腸道內(nèi)寄生，糞便或屠宰后的腸內(nèi)容物散布于周圍環(huán)境中，進(jìn)而污染肉類或其他食品，造成食物中毒。可引起急性胃腸炎，也可導(dǎo)致心內(nèi)臘炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥和血栓靜脈等全身性疾病，還與人的急性感染性多發(fā)性神經(jīng)根神經(jīng)病，即格林巴利綜合征的發(fā)生有密切關(guān)系。近年來，空腸彎曲菌感染的高發(fā)生率及其相關(guān)疾病的危害已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。目前空腸彎曲菌檢驗(yàn)仍以傳統(tǒng)的培養(yǎng)法為主，但操作繁瑣，耗時(shí)長，需4-5 d時(shí)間，才能最后確定是否為空腸彎曲菌，因此影響食物中毒的快速診斷和處理。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的快速診斷，然而傳統(tǒng)PCR技術(shù)易污染，造成檢測結(jié)果的假陽性。1996年美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)推出熒光定量PCR儀，實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍。由于其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)迅速成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。目前，該項(xiàng)技術(shù)已被應(yīng)用于病原體測定、腫瘤基因檢測、免疫分析、基因表達(dá)、突變及其多態(tài)性的研究等多個(gè)領(lǐng)域。因此，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)開發(fā)一種用于快速檢測空腸彎曲菌的試劑盒是十分必要的。 【
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
】 本專利技術(shù)的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快且通量高的空腸彎曲菌熒光定量PCR檢測試劑盒，與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法和生化鑒定相比，具有更加省時(shí)、操作簡便和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。 本專利技術(shù)主要包括試劑盒的組成和使用方法。 空腸彎曲菌熒光定量PCR檢測試劑盒包括=(I)DNA提取液，(2) PCR反應(yīng)預(yù)混液， (3)熱啟動(dòng)Taq酶，(4)陽性標(biāo)準(zhǔn)品，(5)陰性質(zhì)控品；具體的說: (I)DNA提取液 DNA 提取液包含:10mM Tris-HCl, ImM EDTA，ρΗ=8.0，體積分?jǐn)?shù)為 10% 的 Chexe-100。 (2) PCR反應(yīng)預(yù)混液 PCR反應(yīng)預(yù)混液包括PCR反應(yīng)緩沖成分(50mM KCl, 1mM Tris-HCl，pH 8.5)，各400 μ mol/L 的上游引物 hipO-1 和下游引物 hip0_2，200 μ mol/L 熒光探針 hip0_3，5mmol/L的MgCl2,4mmol/L的dNTPs (dATP，dGTP，dCTP和dTTP等體積混合物)和無菌雙蒸水；hipO-Ι 序列為:5 ' - CCTCACTAGCAAAATCCACAGCTT- 3 ;， hipO-2 序列為:5 ' - TGCACAGGCTAATGATATAGRGATTA- 3 ' (R=A/G),hipO-3 序列為:5 ; - TATTCATAGTCACTGGTGCAAC- 3 ;，其中 5 ;標(biāo)記 FAM 基團(tuán)，3 ;標(biāo)記MGB基團(tuán)。 (3)熱啟動(dòng)酶熱啟動(dòng)Taq酶的濃度為5U/ul，每反應(yīng)體系加入IU。 (4)陽性標(biāo)準(zhǔn)品陽性標(biāo)準(zhǔn)品是空腸彎曲菌特異性馬尿酸酶(hippurate hydrolase ,hipO)基因中部分核酸片段連接到T載體上構(gòu)建的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在大腸桿菌中繁殖后，經(jīng)純化，可以用紫外分光光度法測定濃度后，稀釋到16拷貝/y L，即為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。 連接到T載體上的hipO基因核酸片段的序列為: CCTCACTAGCAAAATCCACAGCTTCATCGTTATTCATAGTCACTGGTGCAACAACATTTTTATTGATTTTAAT CCCTATATCATTAGCCTGTGCA。 (5)陰性質(zhì)控品陰性質(zhì)控品為無菌雙蒸水。 本試劑盒的使用方法包括以下步驟:(1)樣品處理及DNA提取；(2)配制PCR反應(yīng)液；(3)在PCR反應(yīng)液中分別加入樣本DNA提取，陰性質(zhì)控品和陽性標(biāo)準(zhǔn)品；(4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(5)對(duì)熒光PCR結(jié)果進(jìn)行分析。 本試劑盒和傳統(tǒng)的培養(yǎng)法比較，具有以下優(yōu)勢(shì):(I)檢測速度快，檢測時(shí)間從4-5天縮短至幾個(gè)小時(shí)左右；(2 )特異性好，經(jīng)測試與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、假單胞菌、志賀氏菌及李斯特氏菌等10幾種常見的食源性致病菌無交差反應(yīng)；(3)靈敏度高，最低檢測限分別達(dá)到9個(gè)拷貝DNA/反應(yīng)；(4)檢測通量高，一次最多可以檢測94個(gè)樣本；(5)比培養(yǎng)法操作步驟簡單。 與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法和生化鑒定相比，本專利技術(shù)提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快且通量高的空腸彎曲菌熒光定量PCR檢測試劑盒，具有更加省時(shí)、操作簡便和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。 【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合具體具體實(shí)施實(shí)例，對(duì)本專利技術(shù)進(jìn)一步說明，但專利技術(shù)的保護(hù)范圍并不限于此。 實(shí)施例1:空腸彎曲菌熒光定量PCR檢測試劑盒的試劑組成每個(gè)試劑盒為48個(gè)反應(yīng)，主要成分包括: (I)DNA提取液DNA提取液成分為:10mM Tris-HCl, ImM EDTA，pH=8.0,體積分?jǐn)?shù)為10%的Chexe-1OO ;共 5ml。 (2) PCR反應(yīng)預(yù)混液 PCR反應(yīng)預(yù)混液包括PCR反應(yīng)緩沖成分(50mM KCl, 1mM Tris-HCl，pH 8.5)，各400 μ mol/L 的上游引物 hipO-Ι 和下游引物 hip0_2，200 μ mol/L 熒光探針 hip0_3，5mmol/L的MgCl2,4mmol/L的dNTPs (dATP, dGTP, dCTP和dTTP等體積混合物)和無菌雙蒸水；共2管，每管llOOul。 (3)熱啟動(dòng)酶熱啟動(dòng)Taq酶的濃度為5U/ul ;共1ul。 (4)陽性標(biāo)準(zhǔn)品陽性標(biāo)準(zhǔn)品是空腸彎曲菌特異性馬尿酸酶(hippurate hydrolase ,hipO)基因中部分核酸片段連接到T載體上構(gòu)建的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在大腸桿菌中繁殖后，經(jīng)純化，可以用紫外分光光度法測定濃度后，稀釋到16拷貝/y L，即為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。；共lOOul。 (5)陰性質(zhì)控品陰性質(zhì)控品為無菌雙蒸水；共200ul。 實(shí)施例2:空腸彎曲菌熒光定量PCR檢測試劑盒檢測空腸彎曲菌具體方法為:(1)樣品處理及DNA提取樣品處理的方法參照GB/T 4789.9-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)空腸彎曲菌檢驗(yàn)》進(jìn)行。 取增菌液lmL，10 OOOrpm離心5分鐘，棄上清保留沉淀，加入10uL DNA提取液，充分振蕩混勻；100°c沸水浴或干浴10分鐘；10 OOOrpm離心5分鐘；取上清2.0uL作為PCR擴(kuò)增的模板，其余保存在_20°C。(若提取的上清當(dāng)天未進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建議_20°C保存不超過I個(gè)月；再次使用時(shí)，應(yīng)先10 OOOrpm離心5分鐘。)(2)配制PCR反應(yīng)液并加樣取5ul的熱啟動(dòng)Taq酶加入到IlOOul的PCR反應(yīng)預(yù)混液，按每管18ul分裝到PCR管，分別加入2ul的樣本上清液，陰性質(zhì)控品和陽性標(biāo)準(zhǔn)品。 (3) PCR 擴(kuò)增PCR擴(kuò)增的條件為:95°C預(yù)變性5min ;擴(kuò)增4本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于檢測空腸彎曲菌DNA存在的快速熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于：由DNA提取液、PCR反應(yīng)預(yù)混液、熱啟動(dòng)Taq?酶、陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性質(zhì)控品組成；所述的DNA是脫氧核糖核酸，所述的PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的Taq酶是一種耐熱的DNA聚合酶。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測空腸彎曲菌DNA存在的快速熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于: 由DNA提取液、PCR反應(yīng)預(yù)混液、熱啟動(dòng)Taq酶、陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性質(zhì)控品組成；所述的DNA是脫氧核糖核酸,所述的PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),所述的Taq酶是一種耐熱的DNA聚合酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征是:PCR反應(yīng)預(yù)混液包括PCR反應(yīng)緩沖成分(50mM KCl, 1mM Tris-HCl，pH 8.5)，各 400 μ mol/L 的上游引物 hipO-1 和下游引物 hip0-2，200ymol/L 熒光探針 hipO-3，5mmol/L 的 MgCl2,4mmol/L 的 dNTPs (dATP,dGTP，dCTP和dTTP等體積混合物)和無菌雙蒸水； hipO-Ι 序列為:5 ' - CC...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉代新，潘海云，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海同科生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31