斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8基因及其編碼的蛋白制造技術

本發明專利技術公開了斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8基因及其編碼的蛋白，本發明專利技術提供的基因不僅為研究斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8在卵巢發育中的作用奠定基礎，而且可以為斑節對蝦養殖過程中所出現的性腺發育參差不齊的情況從分子層面提供理論基礎；其技術要點，該基因序列如SEQ?ID?NO:1所示；編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；屬于生物基因技術領域。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術公開了斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8基因及其編碼的蛋白，屬于生物基因

技術介紹
細胞周期調控是一個精確調控的過程。在細胞分裂過程中真核生物的細胞周期可以概括為兩個大的階段：細胞分裂間期(即G1時期、S時期和G2時期)和細胞分裂期(即M時期)，在細胞分裂時期，需要許多周期蛋白參與調控以保證其精確性。CDK8是細胞核絲氨酸-蘇氨酸激酶，功能是與cyclin?C結合，作為DNA結合轉錄因子和RNA聚合酶II的中介蛋白復合體的重要亞基，參與細胞的轉錄調節。CDK8與轉錄起始相關的TFIIH(cyclin?H/CDK7/Mat1復合物)、Med12、Med13、RNAPII等相互作用共同調控轉錄的起始。細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶家族，CDKs的激酶活性取決于結合的細胞周期蛋白(cyclin)和全酶的完整性，cyclin通過與CDKs特異性結合位點的結合調控底物專一性的CDKs的激酶活性，CDKs主要參與調控細胞周期、轉錄和神經元功能，哺乳動物中報道的CDKs約有20種，包括CDK1-CDK19。其中CDK8作為轉錄起始過程中重要的調控因子在人的研究中最為廣泛和深入，大多集中在腫瘤治療和細胞信號通路方面。1995年人們在尋找依賴cyclinC的激酶時確認了CDK8，并通過實驗證明CDk8在生物體內和體外都能夠和cyclin?C結合，CDK8作為細胞生長調控的中間信號，之后的實驗驗證了CDK8在轉錄調控中的重要作用。近年來CDK8和cyclin?C的異常表達經常在各類人類腫瘤中發現，尤其在結腸和直腸癌中的研究較多。CDK8作為中介蛋白復合體的關鍵組分在轉錄等過程中的作用機理是當前研究的熱點。繼人CDk8(Homo?sapiens，NM_001260.1)被克隆出來以后，其它物種的CDK8也得到了不同程度的研究，如小鼠(Mus?musculus，NM_153599.3)、斑馬魚(Danio?rerio，NM_194408.1)、果蠅(Drosophila?melanogaster，U33015.1)等，但在對蝦中的研究還較少。斑節對蝦(Penaeus?monodon)是世界三大對蝦養殖品種之一，人工育種過程中廣泛采用的剪除單側眼柄的技術會導致親蝦的高死亡率和產卵質量低等問題。
技術實現思路
針對上述問題，本專利技術的是以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎設計的PCR擴增引物，并通過RACE技術克隆到斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8基因的全表達序列；此外通過斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8基因設計熒光定量PCR引物，對細胞周期蛋白依賴性激酶8在斑節對蝦卵巢各個發育時相的分布情況及在不同組織中的分布情況進行研究分析。本專利技術構建了細胞周期蛋白依賴性激酶8原核表達重組質粒，通過原核表達和親和層析技術在體外成功獲得重組蛋白。本專利技術提供的斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8基因，該基因序列如SEQ?ID?NO:1所示。該基因的制備方法依次包括下述步驟：1、總RNA的提取取健康斑節對蝦，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃等組織，并分別將組織于1mL?Trizol(Invitrogen，日本)中勻漿，按Trizol試劑盒使用手冊提取斑節對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，電泳觀察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。2、cDNA第一鏈的合成取上述斑節對蝦總RNA?2μL與反轉錄引物(5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3)1μL(10pmol/L)混合在反轉錄酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一鏈，反應條件：42℃60min，70℃15min。3、斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8的PCR擴增、克隆根據已獲得EST序列設計基因特異性引物，利用cDNA末端快速擴增技術和半巢式PCR技術擴增斑節對蝦CDK8基因的3′和5′未知序列。在3′RACE中，一擴使用正向引物K8FSP1(5>CTCCAGAGAGTATTCCTTTCACACG<3)和接頭通用引物AP(5>GGCCACGCGACTAGTAC<3)；二擴使用正向引物K8FSP2(5>GCAGGTCACAAAGGGAATGGTCAAG<3)和接頭通用引物AP(5>GGCCACGCGACTAGTAC<3)。在5′RACE中，以K8RSP1(5>TGCTGACATAGACAATCCAGTGCCT<3)和oligo-dG為引物進行一擴，用K8RSP2(5>GGATGTTTCAACTCTCGCAGCAATG<3)和oligo-dG(5>GGGGGGGGGGGGGGG<3)進行二次PCR。4、對斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8基因的測定所得到的PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌(Escherichia?coli)DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆進行測序。測序結果用BLAST軟件進行同源性測定，來確定為斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8基因同源序列。5、斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8的分布和表達提取健康的斑節對蝦不同組織(包括卵巢、肝胰腺、腦、心、腸、血和淋巴)以及不同發育時期的卵巢的總RNA，按照PremeScriptTM?RT?reagent?Kit(TaKaRa)操作手冊進行反轉錄為cDNA模板。將不同組織樣品cDNA稀釋1倍作為模板，采用SYBR?GreenⅠ染料法，在Roche熒光定量PCR儀上進行擴增和數據分析。依照TaKaRaPrimeScriptTMRTPCR?Kit(Perfect?Real?Time)試劑盒說明書進行PCR反應。反應體系為10μL，包含5μL的2×SYBR?Green?Real-time?PCR?Master?Mix，3μL稀釋的模板，各0.2μL正、反引物(10μmol/L)及1.6μL的雙蒸水。每個時間點設置3個重復。反應參數為95℃預變性10s；然后95℃變性15s，60℃退火延伸20s，共45個循環。使用引物reCDK8-F(5>TGACTTTCGGACTGTTTCGC<3)和reCDK8-R(5>TTCCTTTCCCCTTACGCTTT<3)擴增目標基因，RTEF-F(5>AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT<3)和RTEF-R(5>CGTGGTGCATCTCCAC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ?ID?NO:1所示。

【技術特征摘要】
1.斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ?ID?
NO:1所示。
2.權利要求1所述的斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8基因編碼的蛋白，其特征在于，
所述蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。
3.權利要求1或者2所述的斑節對蝦細胞周期蛋白依賴性激酶8在斑節對蝦不同組織和
發育各時期分布、表達。
4.含有權利要求1或2所述基因的重組質...

【專利技術屬性】
技術研發人員：邱麗華，傅明駿，趙超，郭松，江世貴，周發林，
申請(專利權)人：中國水產科學研究院南海水產研究所，
類型：發明
國別省市：廣東;44