級聯激活的免疫細胞、制備方法以及應用技術

本發明專利技術提供一種級聯激活的免疫細胞、制備方法以及應用，所述制備方法包括以下步驟：分離得到單核細胞；進行培養，加入CD3抗體和干擾素γ，初級刺激單核細胞，進入初級刺激孵育期，培養；加入IL-2、IL-4、IL-1和巨噬細胞集落刺激因子,進一步活化培養，得到活化后的外周血單核細胞。通過上述方法得到的活化后的外周血單核細胞，可用于制備治療乳腺癌、惡性黑色素瘤的藥物。

【技術實現步驟摘要】
級聯激活的免疫細胞、制備方法以及應用
本專利技術涉及生物
，特別是涉及一種級聯激活的免疫細胞、制備方法和應用。
技術介紹
CD3體外活化T細胞在特定細胞因子環境下會引起其他細胞，特別是抗原呈遞細胞(APC)的激活。抗原呈遞細胞，也被稱為信息細胞，在血液中循環，并提呈外源蛋白，腫瘤蛋白作為變異的非自體抗原也可被其提呈。在APC中，樹突狀細胞(DC)是抗原提呈效力最高的一種細胞，DC可通過特定細胞因子(如IL-4、GMCSF)活化外周血中的單細胞(monocytes)獲得，腫瘤抗原加DC現正作為腫瘤疫苗在腫瘤治療方面進行實驗。如果未經活化的T細胞被加入到活化的呈遞腫瘤抗原的APC中，T細胞的活化和啟動可通過特異性I細胞受體完成，從而獲得特異性識別和殺傷腫瘤的能力。這種利用抗原呈遞細胞結合抗CD3單克隆抗體及特定細胞因子的兩步法鏈式反應激活的細胞被稱為CAPRI細胞。CAPRI細胞療法的效應細胞(具有殺傷腫瘤細胞能力的細胞)有兩種：以CD4+和CD8+為主的T輔助細胞和T殺傷細胞(細胞毒細胞)，約占80％，以CD3+和CD56+為主的NKT細胞、以及NK細胞和樹突狀細胞(DC)，這部分效應細胞約占20％。
技術實現思路
本專利技術的目的之一在于提供一種新的激活的免疫細胞的制備方法。實現上述目的的技術方案如下：一種激活的免疫細胞的制備方法，包括以下步驟：分離得到外周血單核細胞；分離后的單核細胞與CD3抗體共培養2～4小時后，加入干擾素γ共培養20～24小時，初級刺激單核細胞，進入初級刺激孵育期；加入IL-2(白細胞介素-2)、IL-4(白細胞介素-4)、IL-1(白細胞介素-1)和巨噬細胞集落刺激因子,進一步活化培養70～72小時，從而進入連續刺激效應細胞表達，得到級聯激活的免疫細胞。在其中一個實施例中，進行培養時單核細胞的接種密度為1～2x109/L，0.5ml/孔，所述CD3的加入量為1～2ug，干擾素γ的加入量為1000～2000IU。每孔中加入的所述IL-2、IL-4、IL-1和巨噬細胞集落刺激因子的量分別為：1000～2000IU、100～200ng、40～60ng和300～500ng。本專利技術的另一個目的是提供一種級聯激活的免疫細胞。具體技術方案如下。一種級聯激活的免疫細胞，其通過上述制備方法得到。本專利技術的另一目的是提供所述級聯激活的免疫細胞的應用。具體技術方案如下。上述級聯激活的免疫細胞，在制備治療乳腺癌的藥物中的應用。本專利技術的另一目的是提供一種治療乳腺癌的藥物。具體技術方案如下。一種治療乳腺癌的藥物，其活性成分包括有上述級聯激活的免疫細胞。本專利技術的另一目的是提供一種治療惡性黑色素瘤的藥物。具體技術方案如下。上述活化后的級聯激活的免疫細胞，在制備治療惡性黑色素瘤的藥物中的應用。具體技術方案如下。一種治療惡性黑色素瘤的藥物，其活性成分包括有上述級聯激活的免疫細胞。本專利技術的專利技術人通過長期的實驗，發現初級刺激外周血單核細胞過程中，CD3抗體和干擾素γ的加入順序和濃度的不同會對結果有較大影響，本專利技術的方案會對免疫細胞的增殖速率會有顯著的提升；且本專利技術提供方案所得到的免疫細胞(CAPRI)的效應細胞CD3+CD56+的比值也有顯著提升。鏈式激活的免疫細胞對乳腺癌細胞能有較好的裂解，且對惡性黑色素瘤細胞的增殖也有較好的抑制作用。CAPRI細胞用于臨床上，整個治療過程是安全的，沒有負面效果。在一周內即可獲得大量具有癌癥特異性CAPRI細胞，可用以對不同類型的癌癥進行有效的過繼性細胞治療。附圖說明圖1為實施例1中級聯激活的免疫細胞的制備步驟示意圖；圖2為實施例2中CAPRI細胞培養過程中細胞狀態示意圖；圖3為實施例2中細胞流式檢測示意圖；圖4為實施例3中細胞增殖和流式檢測結果比對圖；圖5為實施例4中級聯激活的CAPRI細胞對乳腺癌細胞的裂解測試結果示意圖；圖6為實施例5中級聯激活的CAPRI細胞對惡性黑色素瘤細胞增殖的MTT抑制實驗檢測示意圖。具體實施方式實施例1本實施例所述的級聯激活的免疫細胞通過以下方法得到。1.單核細胞的獲得(見附圖1)1.1新鮮乳腺癌患者外周血(山東省某醫學院附屬醫院患者提供)(肝素抗凝20u/ml)取樣(供后續檢測備用)，將剩余外周血與生理鹽水照按1：1稀釋；1.2在50ml離心管中預先加入淋巴細胞分離液15ml，再加入稀釋好的外周血25ml；1.3小心的將稀釋后的血液加到分離液的上面；1.4離心：轉速：1500r/min，溫度20℃～28℃，時間：20min；1.5離心管內順次為血漿－－單個核細胞層－－分離液－－紅細胞；1.6用移液管吸出單個核細胞層，重懸于2～5倍體積的生理鹽水中；1.7離心：轉速：2000～2300r/min，時間：10min，溫度：4℃；1.8離心后，棄上清液，細胞沉淀重懸于1ml完全培養基中(含10％FCS的RPM-1640培養液)。2.CD3抗體和干擾素γ，初級刺激單核細胞(見附圖1)2.1調整細胞密度為1～2x109/L，放入48孔培養板，0.5ml/孔，CD3的加入量為1ug，置于37℃，5％CO2的恒溫二氧化碳培養箱中培養4小時；2.2每孔加入1500IU干擾素γ再次活化效應細胞；2.3將初次激活的細胞置于37℃，5％CO2的恒溫二氧化碳培養箱中培養20小時。3.單核細胞的第二步激活(見附圖1)3.1將2.3中培養20小時后培養物收集到50ml離心管中，750G離心8分鐘，去上清，用50mlRPMI1640重懸細胞，計數，離心。3.2用完全培養基將所有細胞重懸，調整細胞密度為1～2x109/L，放入48孔培養板，0.5ml/孔，加入IL-2、IL-4、IL-1和巨噬細胞集落刺激因子，每孔加入量分別為：1500IU、1500ng、50ng和400ng。3.3將培養板放置于37℃，5％CO2的恒溫二氧化碳培養箱中培養72小時。4.級聯激活的免疫細胞的擴增培養和收獲(見附圖1)4.1將經72小時培養的培養物(CAPRI細胞)收集到50ml離心管中，750G離心8分鐘，去上清，用生理鹽水重懸細胞，計數，離心。4.2再次離心后可得有活性的級聯激活的免疫細胞(CAPRI細胞)，用鹽水重懸后備用。實施例21.按上述實施例1中方法獲得級聯激活的免疫細胞(CAPRI細胞)，期間進行細胞狀態觀察(見附圖2)；2.將得到的免疫細胞(CAPRI細胞)，用鹽水調整細胞密度為1～2x109/L，取2ml細胞懸液留樣，待流式檢測；3.準備流式抗體，三種雙色抗體組合物分別為：FITC-IgG/PE-IgG,FITC-CD3/PE-CD56,FITC-CD4/PE-CD25；4.將實施例1和2中的待檢樣品用上述抗體分別染色、固定后，上機檢測；5.上述方法得到的免疫細胞(CAPRI細胞)的流式鑒定顯示：CD3+CD56+為35.98％(見附圖3A)，CD4+CD25+為5.11％(見附圖3B)，而外周血中細胞的流式鑒定顯示：CD3+CD56+為8.38％(見附圖3C)，CD4+CD25+為19.52.11％(見附圖3D)。實施例31.按上述實施例1中方法從外周血中分離獲得單核細胞；2.CD3抗體和干擾素γ，初級刺激單核細胞；2.1實驗組a、實驗組b：調整細胞密度為1～2x109/L本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種級聯激活的免疫細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)分離得到外周血單核細胞；(2)分離得到的單核細胞與CD3抗體共培養2～4小時后，加入干擾素γ共培養20～24小時，初級刺激單核細胞，進入初級刺激孵育期；(3)在上述(2)步中共培養20～24小時結束后，加入IL?2、IL?4、IL?1和巨噬細胞集落刺激因子,進一步活化培養70～72小時，得到級聯激活的免疫細胞。

【技術特征摘要】
1.一種級聯激活的免疫細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)分離得到外周血單核細胞；(2)分離得到的單核細胞與CD3抗體共培養2～4小時后，加入干擾素γ共培養20～24小時，初級刺激單核細胞，進入初級刺激孵育期；(3)在上述(2)步中共培養20～24小時結束后，加入IL-2、IL-4、IL-1和巨噬細胞集落刺激因子,進一步活化培養70～72小時，得到級聯激活的免疫細胞；步驟(2)中進行培養時單核細胞的接種密度為1～2x109/L，0.5mL/孔；所述CD3的加入量為1～2μg/孔，干擾素γ的加入量為1000～2000IU/孔；步驟(3)中，每孔中加入的所述IL-2、IL-4、IL-1和巨噬細胞集落刺激...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄒漢東，于兆學，夏凡，
申請(專利權)人：廣州潔漢生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44