一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于體外培養(yǎng)免疫細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明專利技術(shù)培養(yǎng)基包括以下成分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，殼聚糖，精氨酸，谷氨酰胺，維生素A，維生素C，嵌段式聚醚F?68，硫酸鋅，γ?干擾素，胰島素，檸檬酸鐵，氯化鐵，EDTA?2Na和酚紅鈉。本發(fā)明專利技術(shù)免疫培養(yǎng)基，不僅克服了現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)基中添加的人或動(dòng)物血清及組分受限供體的相異性導(dǎo)致質(zhì)量每批間存在差異的缺陷等問(wèn)題，而且顯著提高免疫細(xì)胞的增殖速度、細(xì)胞存活率和殺瘤率。本發(fā)明專利技術(shù)免疫細(xì)胞培養(yǎng)基成分明確、簡(jiǎn)單、成本低，符合免疫細(xì)胞生長(zhǎng)所需的條件，便于免疫細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基
本專利技術(shù)屬于體外培養(yǎng)免疫細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基。
技術(shù)介紹
腫瘤過(guò)繼免疫治療(adoptiveimmunotherapy，ACI)是指通過(guò)向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，直接殺傷或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的。它包括非特異性激活和特異性激活的效應(yīng)細(xì)胞，前者是采用非特異性刺激因子(IL2、干擾素)刺激前體效應(yīng)細(xì)胞，使其活化為具有抗腫瘤活性的效應(yīng)細(xì)胞，如LAK細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokineinducedkillcells，CIK)等；特異性激活的效應(yīng)細(xì)胞是指采用腫瘤抗原作刺激物所誘導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CD8+細(xì)胞)等。無(wú)血清培養(yǎng)基是指不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基，可以應(yīng)用于培養(yǎng)免疫細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞(例如，T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等)、樹(shù)突狀細(xì)胞(也稱DC細(xì)胞)、單核/巨噬細(xì)胞等。關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)體系，現(xiàn)有技術(shù)中除了常規(guī)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等二維的細(xì)胞培養(yǎng)體系，現(xiàn)在已研發(fā)出三維培養(yǎng)體系，例如目前市售的高密度細(xì)胞培養(yǎng)桶，是一種既可以適用于貼壁細(xì)胞，又可以適用于懸浮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系，可以快速地培養(yǎng)大量細(xì)胞，且可以進(jìn)行為期半年以上的長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)，不需要經(jīng)常更換耗材，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶相比，更方便、成本更低，因此受到本領(lǐng)域研發(fā)人員的廣泛關(guān)注。然而，現(xiàn)有技術(shù)中的無(wú)血清培養(yǎng)基大多適用于中等規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)體系，一般來(lái)說(shuō)無(wú)法適用于大規(guī)模的、高密度的細(xì)胞培養(yǎng)；另一方面，現(xiàn)有的無(wú)血清培養(yǎng)基僅適用于培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等二維的細(xì)胞培養(yǎng)體系，無(wú)法適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)桶這樣的三維培養(yǎng)體系。中國(guó)專利申請(qǐng)(CN106047807A)公布了一種適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的免疫細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，其包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、人白蛋白12-16g/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白20-25mg/L、人重組胰島素24-30mg/L，L-谷氨酰胺8-10g/L、HEPES5-7g/L以及白介素-23x105-8x105IU/L。因此，開(kāi)發(fā)專用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的免疫細(xì)胞的培養(yǎng)基是目前免疫細(xì)胞生產(chǎn)所迫切需要的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)提供了一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基。本專利技術(shù)免疫細(xì)胞培養(yǎng)基組分簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低，極大地提高了免疫細(xì)胞的增殖速度和存活率，不僅適用于免疫細(xì)胞中小規(guī)模的生產(chǎn)，同時(shí)也適用于免疫細(xì)胞的高密度培養(yǎng)體系。本專利技術(shù)通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，包括以下成分及其濃度：基礎(chǔ)培養(yǎng)基6.5-13g/L，殼聚糖1.5-3g/L，精氨酸395-455mg/L，谷氨酰胺17-21g/L，維生素A30-45mg/L，維生素C15-20mg/L，嵌段式聚醚F-6840-50mg/L，硫酸鋅1-2mg/L，γ-干擾素250-330IU/mL，胰島素25-30μg/L，檸檬酸鐵4.5-7mg/L，氯化鐵0.15-1.5mg/L，EDTA-2Na3.15-4.5mg/L和酚紅鈉6.35-6.5mg/L。優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)基由以下成分及濃度組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基干粉8.5g/L，殼聚糖2.75g/L，精氨酸415mg/L，谷氨酰胺19.3g/L，維生素A37.4mg/L，維生素C18.65mg/L，嵌段式聚醚F-6843.45mg/L，硫酸鋅1.75mg/L，γ-干擾素289IU/mL，胰島素26.75μg/L，檸檬酸鐵6.43mg/L，氯化鐵1.32mg/L，EDTA-2Na3.68mg/L和酚紅鈉6.45mg/L。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基中基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM、HamF12、PRMI1640中任一種。本專利技術(shù)免疫細(xì)胞培養(yǎng)基成分是經(jīng)過(guò)科學(xué)方法篩選得到的，殼寡糖(分子式：C12H24N2O9，CAS號(hào)：148411-57-8)是自然界中唯一的堿性多糖，具有多種生理活性，如抗菌，抗病毒，抗腫瘤以及增強(qiáng)免疫力等。精氨酸在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)免疫細(xì)胞對(duì)單核吞噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞(除殺傷亞群外)、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞均有直接或間接的有益作用。淋巴細(xì)胞增殖分化、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌過(guò)氧化物和吞噬異物都需要利用谷氨酰胺，培養(yǎng)液內(nèi)谷氨酰胺缺乏或利用率降低會(huì)嚴(yán)重阻礙免疫細(xì)胞增殖和免疫功能的正常發(fā)揮，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。谷氨酰胺在淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞內(nèi)具有高利用率，在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起到非常重要發(fā)的調(diào)節(jié)作用。維生素A、維生素C和硫酸鋅對(duì)免疫細(xì)胞生長(zhǎng)均具有促進(jìn)作用。檸檬酸鐵，氯化鐵，EDTA-2Na組合可替代轉(zhuǎn)鐵蛋白。嵌段式聚醚F-68(CAS號(hào)：9003-11-6)用于防剪切保護(hù)。優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)基制備方法，包括以下步驟：(1)準(zhǔn)確稱取相應(yīng)濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基干粉、殼聚糖、精氨酸、維生素A、維生素C、嵌段式聚醚F-68、硫酸鋅、檸檬酸鐵、氯化鐵、EDTA-2Na和酚紅鈉，溶于體積為800mL，溫度為20-30℃超純水中，攪拌至溶解完全，得溶液I；(2)向上述溶液I中加入相應(yīng)濃度的谷氨酰胺、γ-干擾素和胰島素，攪拌均勻，加入溫度為20-30℃超純水至體積為1L，得溶液II；(3)用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)溶液II的pH至7.2，得溶液III；(4)將溶液III用0.22μm濾膜正壓過(guò)濾除菌，即得。本專利技術(shù)免疫細(xì)胞培養(yǎng)基與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：(1)本專利技術(shù)免疫培養(yǎng)基，不僅克服了現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)基中添加的人或動(dòng)物血清及組分受限供體的相異性導(dǎo)致質(zhì)量每批間存在差異的缺陷等問(wèn)題，而且顯著提高免疫細(xì)胞的增殖速度和細(xì)胞存活率；(2)本專利技術(shù)免疫細(xì)胞培養(yǎng)基顯著提高了免疫細(xì)胞的殺瘤率；(3)本專利技術(shù)免疫細(xì)胞培養(yǎng)基成分明確、簡(jiǎn)單、成本低，符合免疫細(xì)胞生長(zhǎng)所需的條件，便于免疫細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)。附圖說(shuō)明圖1：不同培養(yǎng)基中淋巴細(xì)胞殺瘤率對(duì)比柱狀圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但這并非是對(duì)本專利技術(shù)的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本專利技術(shù)的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本專利技術(shù)的基本思想，均在本專利技術(shù)的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基由以下成分及濃度組成：PRMI1640干粉8.5g/L，殼聚糖2.75g/L，精氨酸415mg/L，谷氨酰胺19.3g/L，維生素A37.4mg/L，維生素C18.65mg/L，嵌段式聚醚F-6843.45mg/L，硫酸鋅1.75mg/L，γ-干擾素289IU/mL，胰島素26.75μg/L，檸檬酸鐵6.43mg/L，氯化鐵1.32mg/L，EDTA-2Na3.68mg/L，酚紅鈉6.45mg/L。一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基制備方法，包括以下步驟：(1)準(zhǔn)確稱取相應(yīng)濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基干粉、殼聚糖、精氨酸、維生素A、維生素C、嵌段式聚醚F-68、硫酸鋅、檸檬酸鐵、氯化鐵、EDTA-2Na和酚紅鈉，溶于體積為800mL，溫度為20-30℃超純水中，攪拌至溶解完全，得溶液I；(2)向上述溶液I中加入相應(yīng)濃度的谷氨酰胺、γ-干擾素和胰島素，攪拌均勻，加入溫度為20-30℃超純水至體積為1L，得溶液II；(3)用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)溶液II的pH至7.2，得溶液III；(4)將溶液III用0本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下成分及其濃度：基礎(chǔ)培養(yǎng)基6.5?13g/L，殼聚糖1.5?3g/L，精氨酸395?455mg/L，谷氨酰胺17?21g/L，維生素A?30?45mg/L，維生素C?15?20mg/L，嵌段式聚醚F?68?40?50mg/L，硫酸鋅1?2mg/L，γ?干擾素250?330IU/mL，胰島素25?30μg/L，檸檬酸鐵4.5?7mg/L，氯化鐵0.15?1.5mg/L，EDTA?2Na?3.15?4.5mg/L和酚紅鈉6.35?6.5mg/L。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下成分及其濃度：基礎(chǔ)培養(yǎng)基6.5-13g/L，殼聚糖1.5-3g/L，精氨酸395-455mg/L，谷氨酰胺17-21g/L，維生素A30-45mg/L，維生素C15-20mg/L，嵌段式聚醚F-6840-50mg/L，硫酸鋅1-2mg/L，γ-干擾素250-330IU/mL，胰島素25-30μg/L，檸檬酸鐵4.5-7mg/L，氯化鐵0.15-1.5mg/L，EDTA-2Na3.15-4.5mg/L和酚紅鈉6.35-6.5mg/L。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，由以下成分及濃度組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基干粉8.5g/L，殼聚糖2.75g/L，精氨酸415mg/L，谷氨酰胺19.3g/L，維生素A37.4mg/L，維生素C18.65mg/L，嵌段式聚醚F-6843.45mg/L，硫酸鋅1.75mg/L，γ-干擾素289IU/mL，胰島素26.75μg/L，檸...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：嚴(yán)志海，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：嚴(yán)志海，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東,44