土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法。本發(fā)明專利技術(shù)所提供的土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法包括：包括S1)和S2)：S1)用提取土壤微生物DNA的方法提取待測(cè)土壤微生物DNA，得到待測(cè)土壤微生物DNA；S2)以待測(cè)土壤微生物DNA為模板，用鑒定植物病原菌的成套試劑進(jìn)行熒光定量PCR，通過PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度確定待測(cè)土壤中植物病原菌的含量；提取土壤微生物DNA的方法包括S21)和S22)：S21)向土壤中加入提取緩沖液得到細(xì)胞懸液；S22)向細(xì)胞懸液中加入SDS得到細(xì)胞裂解液，所述細(xì)胞裂解液中的SDS的質(zhì)量百分比濃度為4％，裂解細(xì)胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的雜質(zhì)得到所述待測(cè)土壤微生物DNA。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
中土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
土傳病害對(duì)植物危害嚴(yán)重。其病原微生物存在于土壤中，環(huán)境穩(wěn)定、病原抗逆能力強(qiáng)，難以進(jìn)行化學(xué)防治。如：十字花科根腫病(Clubroot)是由專性寄生的蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae?Woronin.)引起的世界性土傳病害。該病為害十字花科白菜、油菜、甘藍(lán)、薹菜等多種栽培品種，致使根部腫大，生長(zhǎng)不良，萎蔫、矮化，產(chǎn)量和質(zhì)量受損，嚴(yán)重威脅十字花科作物的生產(chǎn)。植物土傳病害發(fā)生的主要決定因子是播種前土壤中病原菌的含量，對(duì)土壤中植物病原菌的定量檢測(cè)是采取合理防治措施的基礎(chǔ)。土壤中植物病原菌的檢測(cè)有多種方法，如：種植感病植株、熒光顯微鏡檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、常規(guī)PCR檢測(cè)和熒光定量PCR檢測(cè)等。我國(guó)不同地區(qū)的土壤類別、有機(jī)質(zhì)含量和pH值差異很大。同時(shí)，土壤中富含酚類、酯類、腐植酸、重金屬離子等，影響DNA的提取和后續(xù)的PCR反應(yīng)。目前，土壤樣品DNA的制備多采用試劑盒方法，土壤樣品的處理量為0.25g-1g，其生物學(xué)代表意義差，不適合大量土壤樣品檢測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是如何檢測(cè)土壤中植物病原菌的含量。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)首先提供了土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法。本專利技術(shù)所提供的土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法，包括如下S1)和S2)：S1)、用提取土壤微生物DNA的方法提取待測(cè)土壤微生物DNA，得到待測(cè)土壤微生物DNA；S2)、以所述待測(cè)土壤微生物DNA為模板，用鑒定植物病原菌的成套試劑進(jìn)行熒光定量PCR，通過PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度確定所述待測(cè)土壤中所述植物病原菌的含量；所述鑒定植物病原菌的成套試劑由鑒定所述植物病原菌的PCR引物對(duì)和探針組成；所述PCR引物對(duì)由序列表中SEQ?ID?No.1所示的單鏈DNA和SEQ?ID?No.2所示的單鏈DNA組成；所述探針的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?No.3所示；S1)所述提取土壤微生物DNA的方法包括如下S21)和S22)的步驟：S21)向所述土壤中加入提取緩沖液得到細(xì)胞懸液；S22)向所述細(xì)胞懸液中加入SDS得到細(xì)胞裂解液，所述細(xì)胞裂解液中的SDS的質(zhì)量百分比濃度為4％，裂解細(xì)胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的雜質(zhì)得到所述待測(cè)土壤微生物DNA；所述提取緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為磷酸緩沖液，所述溶質(zhì)及其濃度為1M?Tris-HCl、0.1M?EDTA、1.5M?NaCl、2％(質(zhì)量百分比濃度)CTAB、2％(質(zhì)量百分比濃度)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；所述磷酸緩沖液為由溶質(zhì)和溶劑組成的緩沖液，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為NaH2PO4和Na2HPO4，所述NaH2PO4在所述磷酸緩沖液中的濃度為6.8mM，所述Na2HPO4在所述磷酸緩沖液中的濃度為93.2mM(即所述磷酸緩沖液中H2PO4-和HPO42-的濃度之和為100mM)，所述磷酸緩沖液的pH為8.0。上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述裂解細(xì)胞的時(shí)間可為2小時(shí)，所述裂解細(xì)胞的溫度可為65℃。上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述探針可標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。所述報(bào)告基團(tuán)具體可為FAM或ROX；所述熒光淬滅基團(tuán)具體可為TAMARA或Eclipse。在本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例中，所述探針的5’端標(biāo)記有FAM，所述探針的3’端標(biāo)記有TAMARA。上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，S21)可包括下述S21a)和S21b)：S21a)向所述土壤中加入所述提取緩沖液得到土壤懸液；S21b)破碎所述土壤懸液中的土壤顆粒得到所述細(xì)胞懸液。上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述細(xì)胞懸液中土壤顆粒的直徑在50微米以下。上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述破碎所述土壤懸液中的土壤顆粒可用德國(guó)Retsch生產(chǎn)的PlanetaryBall?Mill?PM?400儀器處理所述土壤懸液。所述處理的時(shí)間可為5-20分鐘，具體可為10分鐘。上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述除去所述裂解液中的雜質(zhì)得到所述待測(cè)土壤微生物DNA包括S22a)和S22b)：S22a)向所述裂解液中加入PEG溶液除去所述裂解液中的雜質(zhì)得到DNA溶液；S22b)用PVPP(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)除去所述DNA溶液中的雜質(zhì)得到所述待測(cè)土壤微生物DNA；上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述PEG溶液由水、NaCl和PEG組成；所述PEG溶液中所述PEG的質(zhì)量百分濃度為20％-50％，所述NaCl的濃度為1.6M。所述PEG具體可為PEG8000。所述20％-50％具體可為30％。上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述S22a)包括A1)和A2)：A1)將所述裂解液進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入上清液中，收集上清液，將該上清液稱為上清液a1，向所述上清液a1中加入氯仿，得到含有DNA的提取液，將該提取液稱為提取液b1；A2)將所述提取液b1進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入上清液中，收集上清液，將該上清液稱為上清液a2，向所述上清液a2中加入所述PEG溶液，得到含有DNA的提取液，將該提取液稱為提取液b2，除去所述提取液b2中的雜質(zhì)，得到所述DNA溶液；上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述PEG溶液的體積可為所述上清液a2體積的1/2。上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述上清液a2和所述PEG溶液的反應(yīng)溫度可為4℃；所述上清液a2和所述PEG溶液的反應(yīng)時(shí)間可為1小時(shí)。上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述除去所述提取液b2中的雜質(zhì)可包括如下步驟：將所述提取液b2進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入沉淀中，收集沉淀，將該沉淀稱為沉淀c1，向所述沉淀c1中加入體積百分比濃度為75％的乙醇水溶液，得到含有DNA的提取液，將該提取液稱為提取液b3，除去所述提取液b3中的雜質(zhì)，得到所述DNA溶液。上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述除去所述提取液b3中的雜質(zhì)可包括如下步驟：將所述提取液b3進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入沉淀中，收集沉淀，將該沉淀稱為沉淀c2，向所述沉淀c2中加入TE?buffer，得到所述DNA溶液；所述TE?buffer由水和溶質(zhì)組成，所述TE?buffer的pH為8.0，所述溶質(zhì)及其濃度為10mM?Tris-HCl、1mM?EDTA。上述土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法中，所述向所述沉淀c2中加入TE?buffer的溫度可為50-60℃。所述50-60℃具體可為55℃。...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法，包括如下S1)和S2)：S1)、用提取土壤微生物DNA的方法提取待測(cè)土壤微生物DNA，得到待測(cè)土壤微生物DNA；S2)、以所述待測(cè)土壤微生物DNA為模板，用鑒定植物病原菌的成套試劑進(jìn)行熒光定量PCR，通過PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度確定所述待測(cè)土壤中所述植物病原菌的含量；所述鑒定植物病原菌的成套試劑由鑒定所述植物病原菌的PCR引物對(duì)和探針組成；所述PCR引物對(duì)由序列表中SEQ?ID?No.1所示的單鏈DNA和SEQ?ID?No.2所示的單鏈DNA組成；所述探針的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?No.3所示；S1)所述提取土壤微生物DNA的方法包括如下S21)和S22)的步驟：S21)向所述土壤中加入提取緩沖液得到細(xì)胞懸液；S22)向所述細(xì)胞懸液中加入SDS得到細(xì)胞裂解液，所述細(xì)胞裂解液中的SDS的質(zhì)量百分比濃度為4％，裂解細(xì)胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的雜質(zhì)得到所述待測(cè)土壤微生物DNA；所述提取緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為磷酸緩沖液，所述溶質(zhì)及其濃度為1M?Tris?HCl、0.1M?EDTA、1.5M?NaCl、2％(質(zhì)量百分比濃度)CTAB、2％(質(zhì)量百分比濃度)PVP；所述磷酸緩沖液由溶質(zhì)和溶劑組成的緩沖液，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為NaH2PO4和Na2HPO4，所述NaH2PO4在所述磷酸緩沖液中的濃度為6.8mM，所述Na2HPO4在所述磷酸緩沖液中的濃度為93.2mM，所述磷酸緩沖液的pH為8.0。...

【技術(shù)特征摘要】
1.土壤中植物病原菌含量的檢測(cè)方法，包括如下S1)和S2)：
S1)、用提取土壤微生物DNA的方法提取待測(cè)土壤微生物DNA，得到待測(cè)土壤微生
物DNA；
S2)、以所述待測(cè)土壤微生物DNA為模板，用鑒定植物病原菌的成套試劑進(jìn)行熒光
定量PCR，通過PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度確定所述待測(cè)土壤中所述植物病原菌的含量；所
述鑒定植物病原菌的成套試劑由鑒定所述植物病原菌的PCR引物對(duì)和探針組成；所述
PCR引物對(duì)由序列表中SEQ?ID?No.1所示的單鏈DNA和SEQ?ID?No.2所示的單鏈DNA
組成；所述探針的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?No.3所示；
S1)所述提取土壤微生物DNA的方法包括如下S21)和S22)的步驟：
S21)向所述土壤中加入提取緩沖液得到細(xì)胞懸液；
S22)向所述細(xì)胞懸液中加入SDS得到細(xì)胞裂解液，所述細(xì)胞裂解液中的SDS的質(zhì)
量百分比濃度為4％，裂解細(xì)胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的雜質(zhì)得到所述待測(cè)
土壤微生物DNA；
所述提取緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為磷酸緩沖液，所述溶質(zhì)及其濃度
為1M?Tris-HCl、0.1M?EDTA、1.5M?NaCl、2％(質(zhì)量百分比濃度)CTAB、2％(質(zhì)量百
分比濃度)PVP；所述磷酸緩沖液由溶質(zhì)和溶劑組成的緩沖液，所述溶劑為水，所述溶
質(zhì)為NaH2PO4和Na2HPO4，所述NaH2PO4在所述磷酸緩沖液中的濃度為6.8mM，所述Na2HPO4在所述磷酸緩沖液中的濃度為93.2mM，所述磷酸緩沖液的pH為8.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：S21)包括下述S21a)和S21b)：
S21a)向所述土壤中加入所述提取緩沖液得到土壤懸液；
S21b)破碎所述土壤懸液中的土壤顆粒得到所述細(xì)胞懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述提取土壤微生物DNA的方
法中，所述除去所述裂解液中的雜質(zhì)得到所述待測(cè)土壤微生物DNA包括S22a)和S22b)：
S22a)向所述裂解液中加入PEG溶液除去所述裂解液中的雜質(zhì)得到DNA溶液；
S22b)用PVPP除去所述DNA溶液中的雜質(zhì)得到所述待測(cè)土壤微生物DNA；
所述PEG溶液由水、NaCl和PEG組成；所述PEG溶液中所述NaCl的濃度為1.6M，
所述PEG的質(zhì)量百分濃度為30％-50％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述S22a)包括A1)和A2)：
A1)將所述裂解液進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入上清液中，收集上清液，將該上清液稱
為上清液a1，向所述上清液a1中加入氯仿，得到含有DNA的提取液，將該提取液稱
為提取液b1；
A2)將所述提取液b1進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入上清液中，收集上清液，將該上清液

\t稱為上清液a2，向所述上清液a2中加入所述PEG溶液，得到含有DNA的提取液，將
該提取液稱為提取液b2，除去所述提取液b2中的雜質(zhì)，...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張力群，郭松，張俊威，陳偉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11