一種抗菌蛋白制造技術

本發明專利技術屬于生物化學領域,公開了一種對人體無刺激性并且抑菌效果好的抗菌蛋白LYS-ABP和在LYS-ABP蛋白N末端添加有MBP的抗菌蛋白MBP-LYS-ABP及制備方法。本發明專利技術所述抗菌蛋白LYS-ABP和抗菌蛋白MBP-LYS-ABP對人體無刺激性并且抑菌效果好，抑菌效果明顯優于單獨的溶菌酶和抗菌肽蛋白，生物活性穩定性好。本發明專利技術所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP通過體外重組表達獲得，易于制備，成本較低，同時抗菌蛋白MBP-LYS-ABP可溶性表達產量高，適于大量制備。本發明專利技術所述抗菌蛋白LYS-ABP通過凝血酶對重組表達制備的MBP-LYS-ABP融合蛋白進行酶切得到，易于制備，成本較低。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物化學領域，特別涉及一種抗菌蛋白。
技術介紹
消毒是指殺死病原微生物、但不一定能殺死細菌芽孢的方法。用于消毒的物質叫 做消毒劑。而消毒液顧名思義就是液體的消毒劑。理想的消毒劑應具備殺菌譜廣、殺菌能 力強、作用速度快、穩定性好、無毒、無殘留、無腐蝕性、無刺激性、易溶于水、對人和動物安 全及價廉易得、對環境污染程度低等特點。目前消毒液產品主要分為環境消毒類、常規手腳消毒液和創傷消毒液。環境消毒 類消毒液是指主要應用于衛生防疫和災區的常規消毒殺菌、游泳池、賓館、飯店、家庭、學 校、醫院等公共場所消毒的產品，包括84消毒液、過氧乙酸、來蘇水等。常規手腳消毒液是 指主要用于手腳皮膚的產品，包括醋酸氯己定、乙醇為等。而創傷消毒液類主要應用于醫院 內手術或外傷，燒傷以及各種潰瘍的創口消毒，以及個人常規的外傷或潰瘍消毒處理，包括 紫藥水、雙氧水、酒精等。目前，傳統的創傷消毒液在實際應用中有許多缺點，比如紫藥水，即2%的甲紫溶 液，此溶液有加快傷口結痂和愈合的作用，常用于淺表皮膚、黏膜感染，但因該溶液刺激較 大，不宜用在黏膜或開放創面，尤其是大創面，而且可誘發皮膚癌；雙氧水，即過氧化氫，具 有消毒殺菌作用，但濃度過大時易灼傷患處皮膚，且性質不穩定，存放時間不長，易失效； 75%酒精可以有效去除細菌，預防傷口感染，但酒精有破壞細胞和較強的刺激性，故不能用 于傷口內、破潰部位以及眼、鼻、口、陰道等部位粘膜的消毒，另外，酒精貯藏的容器應嚴密， 用后瓶口應塞緊，防止揮發造成含量下降影響殺菌效力。 由此可見，傳統的創傷消毒液往往對傷口或患處有刺激作用。對于化學品消毒劑 還存在著化學殘留的問題，而對于植物提取的消毒液，存在著原料的質量不能保證一致，并 且在提取過程中應用了化學溶劑，也存在著一定的化學殘留的問題。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術的缺點，提供了一種對人體無刺激性并且抑菌效果 好的抗菌蛋白，用于創傷消毒。 為實現本專利技術的目的，本專利技術采用如下技術方案： 一種抗菌蛋白，具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。 在一些實施方案中，所述的抗菌蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。 本專利技術還提供了編碼所述的抗菌蛋白的DNA分子。 其中，在一些實施方案中，編碼SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷 酸序列如SEQ ID N0:3所示。 本專利技術還提供了一種氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示抗菌蛋白的制備方法，將編 碼SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的DNA分子重組到表達載體pMAL-p2x，轉化宿主細胞，并進 行表達、提取、純化。 在一些實施方案中，所述重組為獲取兩端帶有酶切位點的編碼SEQ ID NO: 1所示 的氨基酸序列的DNA分子，將其插入到表達載體pMAL-p2x的酶切位點之間并測序鑒定。 在一些實施方案中，所述酶切位點為EcoRI和Hindlll。 在一些實施方案中，所述大腸桿菌表達菌株為BL21 (DE3 ) pLysS。 在一些實施方案中，所述提取包括細菌收集、破碎，離心取上清。 在一些實施方案中，所述純化為親和層析純化及離子交換純化。 本專利技術提供了一種對人體無刺激性并且抑菌效果好的抗菌蛋白LYS-ABP，具有如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。同時提供了在LYS-ABP蛋白N末端添加有MBP的融合目 的蛋白，即抗菌蛋白MBP-LYS-ABP，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本專利技術所述抗菌蛋 白LYS-ABP和抗菌蛋白MBP-LYS-ABP對人體無刺激性并且抑菌效果好，抑菌效果明顯優于 單獨的溶菌酶和抗菌肽蛋白，生物活性穩定性好。本專利技術還提供了所述抗菌蛋白LYS-ABP 和抗菌蛋白MBP-LYS-ABP的制備方法。本專利技術所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP通過體外重組表 達獲得，易于制備，成本較低，同時抗菌蛋白MBP-LYS-ABP可溶性表達產量高，適于抗菌蛋 白MBP-LYS-ABP的大量制備。本專利技術所述抗菌蛋白LYS-ABP通過凝血酶對重組表達制備的 MBP-LYS-ABP融合蛋白進行酶切得到，易于制備，成本較低，適于抗菌蛋白LYS-ABP的大量 制備。【附圖說明】 圖1為實施例4目的蛋白的商效表達，其中；泳道A為空菌對照；泳道B為 MBP-LYS-ABP融合蛋白；泳道C為分子量Marker，從上到下分別為97. 4kD、66. 2kD、43kD、 31kD、20. lkD ;箭頭所指目標蛋白為抗菌蛋白MBP-LYS-ABP。【具體實施方式】 本專利技術公開了一種抗菌蛋白，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝 參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見 的，它們都被視為包括在本專利技術。本專利技術的產品已經通過較佳實施例進行了描述，相關人 員明顯能在不脫離本
技術實現思路
、精神和范圍內對本文所述的產品進行改動或適當變更與組 合，來實現和應用本專利技術技術。 為實現本專利技術的目的，本專利技術采用如下技術方案： 溶菌酶（lysozyme,LYS)又稱胞壁質酶（muramidase)或N-乙酰胞壁質聚糖水解 酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。溶菌 酶主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的0 -1，4糖苷鍵，使細 胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解，從而達 到殺死細菌的目的。溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白 形成復鹽，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，且無毒、無副作用。 抗菌肽（antimicrobial peptide, ABP)是生物體內經誘導產生的一種具有生物 活性的小分子多肽，分子量在2000~7000左右，由20~60個氨基酸殘基組成，抗菌肽的 抗菌作用機理是抗菌肽分子可以在細菌細胞質膜上穿孔而形成離子孔道，造成細菌細胞膜 結構破壞，引起胞內水溶性物質大量滲出，而最終導致細菌死亡。抗菌肽具有強堿性、熱穩 定性以及廣譜抗菌等特點。抗菌肽對細菌，尤其是對某些耐藥性病原菌有很強的殺傷作用。 此外，某些抗菌肽對部分病毒、真菌、原蟲和癌細胞等有殺滅作用，甚至能提高免疫力、加速 傷口愈合過程。 溶菌酶可以從蛋清中提取而大量得到，但這種方法存在著原材料質量不易控制， 有潛在病菌污染的危險。抗菌肽可以從果蠅中提取得到，但這種方法原材料的來源不易控 制，提取得到的抗菌肽產量低，活性差，質量不穩定也不易控制。此外，溶菌酶和抗菌肽生物 穩定性很差，室溫放置幾天活性就下降至原來的50%以下，因此，溶菌酶或抗菌肽無法單獨 作為創傷消毒劑使用。 本專利技術通過基因工程技術將溶菌酶與抗菌肽融合得到一種抗菌蛋白LYS-ABP，其 具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。本專利技術所述抗菌蛋白LYS-ABP既具有溶菌酶破壞 細胞壁功能又具有抗菌肽破壞細菌細胞膜的功能，同時溶菌酶與抗菌肽產生協同效應大大 增強了抗菌蛋白的殺菌效果。本專利技術所述抗菌蛋白LYS-ABP具有殺菌譜廣、殺菌效果好、種 屬特異性高，無刺激性的特點，從而達到本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抗菌蛋白，其特征在于，具有如SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：申鳴，于志洋，張穎，
申請(專利權)人：長春新悅然科技有限公司，
類型：發明
國別省市：吉林;22