本發明專利技術涉及一種含有24個氨基酸殘基的線性直鏈肽的制備方法，主要解決目前還沒有工業化制備該化合物的方法。本發明專利技術采用固相合成方法及高效液相色譜純化方法，主要包括以下幾個步驟：1）以Fmoc-Tyr(tbu)-王樹脂為起始樹脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶聯每一個保護氨基酸，合成得到側鏈全保護的肽鏈樹脂；2）對側鏈全保護的肽鏈樹脂進行切割，將24肽從樹脂上裂解下來并去除側鏈保護基團，得到兩條抗病毒多肽PY-24及FY-24的粗品；3）將得到的粗品采用高效液相色譜法純化制備從而得到高純度大于98%的多肽精品。本發明專利技術可低成本大規模化生產抗艾滋病毒組合多肽PY-24及FY-24。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及線性直鏈肽的制備方法，特別涉及一種含有24個氨基酸殘基的線性 直鏈肽的制備方法。
技術介紹
艾滋病是以全身免疫系統嚴重損害為特征的傳染性疾病，自其被發現以來，已嚴 重威脅人類的生存，對全球人口健康和社會經濟的發展產生巨大的影響。伴隨著多年來的 研宄，艾滋病在治療上取得了很大的進展，譬如高效抗逆轉錄病毒治療（Highlyactive antiretroviraltherapy,HAART,又稱為"雞尾酒"療法）的應用。雞尾酒療法是通過多種 的抗病毒藥物聯合使用來治療艾滋病，根據此方法的基本原理，針對HIV1的膜融合抑制 劑采用分子生物學手段重組和表達并設計出組合多肽即PY-24和FY-24,該兩條多肽針對 HIV的gp41，和gpl20的靶點，在前期的實驗中證明了它們可對HIV1具有非常好的抑制活 性。PY-24是一種含有24個氨基酸殘基的線性直鏈肽，它的分子式是ClltlH17具6028，分 子量：2444. 81，多肽序列為H-Pro-His-Ser-Gly-Ala-His-Gly-Ile-Pro-Lys-Ile-Phe-Gly -Ala-Arg-Ala-Gln-Pr〇-Ala-Ala-Ala-Arg-Ala-Tyr-〇H，結構式如下(切割兩段）：【主權項】1. ，其特征在于包括以下步驟： 1) 以Fmoc-Tyr(tbu)-王樹脂為起始樹脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶聯每一個保護 氨基酸，合成得到側鏈全保護的肽鏈樹脂； 2) 用切割試劑對側鏈全保護的肽鏈樹脂進行切割，將24肽從樹脂上裂解下來并去除 側鏈保護基團，得到抗病毒多肽PY-24及FY-24粗品； 3) 將得到的抗病毒多肽PY-24及FY-24粗品采用高效液相色譜法，并選取合適的色譜 柱及流動相分離純化，從而制備得到純度大于98%的PY-24及FY-24精品。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)具體內容包括如下步驟： 1) 取Fmoc-Tyr(tbu)-王樹脂用N，N-二甲基甲酰胺浸泡，使樹脂充分溶脹，抽干，加入 脫冒試劑，反應10-30分鐘，抽干，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌5-10次，抽干，以N，N-二甲基 甲酰胺為溶劑，加入Fmoc-Ala-OH，用0-苯并三唑-N，N，N，N-四甲基脲鑰六氟磷酸鹽/1-羥 基苯并三唑、〇-(苯并三唑-1-氧）-N，N，N，N-四甲基脲鑰六氟硼酸鹽/1-羥基苯并三唑、 二異丙基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑中的一種混合物作為縮合劑，再加入N-甲基嗎啉或二 異丙基乙胺中的一種作為有機堿調節反應溶液PH環境，反應0. 5-2小時，茚三酮法檢測反 應終點，抽干，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌3-5次，抽干，獲得Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-王樹脂； 2) 在步驟（1)獲得的Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-王樹脂中，加入脫帽試劑，反應10-30分鐘， 抽干，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌5-10次，抽干，以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑，加入具有芴 甲氧羰基保護的氨基酸，用〇-苯并三唑-N，N，N，N-四甲基脲鑰六氟磷酸鹽/1-羥基苯并三 唑、〇-(苯并三唑-1-氧）-N，N，N，N-四甲基脲鑰六氟硼酸鹽/1-羥基苯并三唑、二異丙基 碳二亞胺/1-羥基苯并三唑中的一種混合物作為縮合劑，再加入N-甲基嗎啉或二異丙基乙 胺中的一種作為有機堿調節反應溶液PH環境，反應0. 5-2小時，茚三酮法檢測反應終點，抽 干，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌3-5次，抽干，然后再加入脫保護試劑，脫保護反應，再加入具 有芴甲氧羰基保護的氨基酸，如此反復，PY-24直至連完最后一個脯氨酸，FY-24直至連完 最后一個苯丙氨酸，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌3-5次，脫保護反應，N，N-二甲基甲酰胺洗 滌5-10次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗滌3次，最后加甲醇收縮樹脂，抽干，真空干燥，得到 側鏈全保護的肽鏈樹脂PY-24 和FY-24,PY-24 即Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(t rt) -Gly-Ile-Pro-Lys(boc) -Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf) -Ala-Gln(Trt) -Pro-Ala-Ala-Al a_Arg(pbf) -Ala-Tyr(tbu)-王樹脂；FY-24 即Phe-Thr(tbu) -Ala-His(trt) -Leu-His(trt) -Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf) -Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf) -Ala-Gln(Trt)-Pr O-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu) -王樹脂； PY-24所涉及具有荷甲氧羰基保護的氨基酸，依次包括Fmoc-Arg(pbf) -0H，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gln(Trt)-〇H，Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(boc)-〇H，Fmoc-Pr〇-〇H，Fmoc-Ile-〇H，Fmoc-Gly-〇H，Fmoc-His(trt)-〇H， Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Ser(tbu) -〇H，Fmoc-His(trt) -〇H，Fmoc-Pro-OH; FY-24所涉及具有荷甲氧羰基保護的氨基酸，依次包括Fmoc-Arg(pbf) -0H，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gln(Trt)-〇H，Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-His(trt)-OH,Fmoc-His(trt)-OH,Fmoc-Thr(tbu)-OH, Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-His (trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr (tbu)-OH， Fmoc-Phe-OH03. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，Fmoc-Tyr (tbu) -王樹脂的取代度在 0. 2mmol/g-〇. 8mmol/g之間，Fmoc-Ala-OH量為Fmoc-Tyr (tbu)-王樹脂摩爾量的 1-5 倍；脫 帽試劑為體積百分含量10-30%的哌啶/N，N-二甲基甲酰胺混合溶液，每一步保護氨基酸的 量的是Fmoc-Tyr (tbu) -王樹脂摩爾量的1-5倍，縮合試劑的量是Fmoc-Tyr (tbu) -王樹脂 摩爾量的1-5倍，有機堿的量是Fmoc-Tyr (tbu)-王樹脂摩爾量的2-10倍，每一步反應終點 的檢測方法所采用的是茚三酮檢測法。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，Fmoc-Tyr(tbu)-王樹脂的取代度 為0. 35mmol/g，Fm本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種含有24個氨基酸殘基的線性直鏈肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟：1）以Fmoc?Tyr(tbu)?王樹脂為起始樹脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶聯每一個保護氨基酸，合成得到側鏈全保護的肽鏈樹脂；2）用切割試劑對側鏈全保護的肽鏈樹脂進行切割，將24肽從樹脂上裂解下來并去除側鏈保護基團，得到抗病毒多肽PY?24及FY?24粗品；3）將得到的抗病毒多肽PY?24及FY?24粗品采用高效液相色譜法，并選取合適的色譜柱及流動相分離純化，從而制備得到純度大于98%的PY?24及FY?24精品。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：徐紅巖，竺劍峰，
申請(專利權)人：吉爾生化上海有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31
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