本發明專利技術公布了三種不同烷基鏈長的雙核釕配合物作為靶向檢測癌細胞溶酶體細胞器熒光探針等相關領域中的應用。配合物可以非常容易地穿透細胞膜并靶向進入溶酶體，用于溶酶體染色；其光致發光的斯托克位移較大，可以有效避免串色干擾；其光穩定性也比較好，適用于長時間的光致發光監測溶酶體的活動。
【技術實現步驟摘要】
本專利屬于熒光生物分子探針領域，涉及雙核釕配合物在靶向檢測癌細胞溶酶體 細胞器熒光探針等相關領域中的應用。
技術介紹
溶酶體是真核細胞內的一種酸性細胞器，負責細胞的消化、降解功能，溶酶體在 細胞各種生命活動，包括物質代謝、細胞膜循環、細胞凋亡中發揮著重要作用（P. Saftig， J. Kl μ mperman，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009,10,623-635 ;G. Kroemer，Μ· Jaattela，Nat. Rev. Cancer 2005,5,886-897 ;M. E. G μ icciardi，M. Leist，G.J. Gores，0ncogene2004， 23,2881-2890)。如果它發生功能紊亂，會引發諸如腫瘤、炎癥、矽肺等多種疾病的產生 (Fehrenbacher，N. Jaattela，ECancer Res. 2005,65, 2993-2995)。溶酶體熒光探針能 夠實現對溶酶體的標記，標記溶酶體位置，直觀地監測溶酶體在生理、病理過程中的動態 變化，對于深入地理解溶酶體參與生命活動的分子機制，而且對疾病的治療具有重要的指 導意義。因此，研究、開發溶酶體熒光探針具有重要的理論意義及實際應用價值。本文中 共提及三個雙核釕配合物可用作溶酶體熒光探針，其中配合物Ru2已經報道于文獻（Liu， P. ；Liu, J. ；Zhang, Y. -Q. ；ffu, B. -Y. ；ffang, K. -Z. J. Photochem. Photobiol. B. 2015,143, 89-99)，但只討論了其細胞吸收的性質并沒有研究其在細胞中的具體定位，本專利技術應用了 細胞核、線粒體、溶酶體三種染料和三個配合物進行共同染色，在共聚焦顯微鏡下觀察到了 三個不同烷基鏈長的雙核釕配合物定位于細胞中的溶酶體。目前具有溶酶體定位能力的雙 核釕配合物熒光探針還未見報道，該研究為開發雙核釕配合物類溶酶體熒光探針提供了有 意義的探索。
技術實現思路
本專利技術的目的是制備三種不同長度烷基鏈的雙核釕配合物，應用了 MTT法（3_(4， 5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽比色法）和高內涵分析法探究了三個配合物 對細胞的毒性，并通過熒光共聚焦方法對三種配合物進行了共定位成像研究，以Hoechst 33342 (三氯化氫2-(4-乙基苯基）-5-(4-甲基-1-哌嗪基）-2, 5-二-IH-苯并咪唑）、 Mitotracker green、LysoTracker green三種焚光探針為標準物，經過共定位分析，證實三 種配合物在癌細胞中能實現對溶酶體的標記。 本專利技術的技術方案如下： 本專利技術采用的三種雙核釕配合物的配體用LI，L2, L3表示，三種配合物用Rul， Ru2, Ru3,代表，結構如下： 上述雙核釕配合物的合成途徑如下所示： η = 10, (ClO4)4 Rul η = 6， (ClO4) 4 Ru2 η = 3， (ClO4) 4 Ru3 toon] 與現有技術相比，本專利技術的有益效果在于：目前已經發現的大多數探針缺乏特異的靶向性，且不能提供客體分布的定量信 息。迫切需要開發出具有細胞器定位功能以及能夠反映客體分布的熒光探針本專利技術合成的 三種配合物與活細胞共同培養即可進入活細胞內，進而特異性地進入細胞內的溶酶體這 一細胞器，導致溶酶體的的熒光強度顯著增強，進而用于癌細胞內溶酶體生理活動的監測。 同時釕配合物相比于傳統溶酶體熒光探針還具有光化學性質穩定、消光系數大、熒光壽命 長和斯托克位移大等特點。且本專利技術第一次使用了高內涵分析的方法來檢測配合物藥物的 細胞毒性，高內涵提供了一種靈敏度高、操作簡便、使用安全的細胞增殖與活性檢測方法， 與傳統的MTT實驗相比具有明顯的優勢。【附圖說明】 圖I HeLa細胞在不同濃度的配合物Rul_Ru3孵育48h后的細胞活性圖 圖2 HeLa細胞在濃度為20微摩的配合物Rul_Ru3孵育24小時后，用Hoechst 33342染色30分鐘后共聚焦圖片 圖3 HeLa細胞在濃度為20微摩的配合物Rul-Ru3孵育24小時后，在 Mitotracker green染色30分鐘后共聚焦圖片 圖4 HeLa細胞在濃度為20微摩的配合物Rul_Ru3孵育24小時后，在 Lysotracker green染色30分鐘后共聚焦圖片 圖5 HeLa細胞在濃度為50微摩的配合物Rul_Ru3孵育24小時后的細胞周期分 布圖 圖6 HeLa細胞在濃度為50微摩的配合物Rul_Ru3孵育24小時后的細胞凋亡百 分比圖 圖7 HeLa細胞在濃度為10微摩和40微摩的配合物Rul和Ru3孵育24小時后 的細胞周期分布和凋亡百分比圖【具體實施方式】 實施例1 :配體LU L2、L3和三個釕配合物的制備 1.前體的制備：1，3_二-(4-醛基-咔唑基）丙烷、1，6_二-(4-醛基-咔唑基） 己烷、1，10-二-(4-醛基-咔唑基）癸烷的合成參照文獻（張玉琦，北京師范大學碩士學位 論文；Zhang，Y. ；ffada, T. and Sasabe, H. Jo μ rnal of Polymer Science ：Part A ：Polymer Chemistry. 1996,34, 2289-2298 ;0stra μ skaite，J. ;Voska，V.and Graz μlevici μ s， J. V. MonatsheftefiirChemie. 2002,133, 599-607.)中方法合成。 2. 1，10-鄰菲羅啉-5,6_二酮的合成：綜合了多種文獻方法的優點，（Amouyal， E. ；Homsi, A. ；Chambron, J. -C. and Sauvage, J. -P. J. Chem. Soc. , Dalton Trans. 1990， 1841-1845 ；Hiort, C. ；Lincoln, P. and Norden, B.J. Am. Chem. Soc. 1993,115,3448-3454 ； Paw, ff. and Eisenberg, R. Inorg. Chem. 1997,36, 2287-2293. ；Calderazzo, F. ；Marchetti, F. ;Pampaloni，G. and Passarelli，V.J. Chem. Soc.，Dalton Trans. 1999,43894396)實驗 之前應將一水合鄰菲羅啉（10克，50毫摩）和溴化鉀（10克，84毫摩）用研缽研細后到入 一個裝有磁子的三口瓶中，封好口后放入冰箱凍一夜，另外，要將濃硫酸（100毫升）和濃硝 酸（50毫升）事先混勻，也放入冰箱中凍一夜。實驗時，先將三口瓶放入冰鹽浴中凍一段時 間，裝上冷凝管，在緩慢地沿著瓶壁加入凍好的混合酸。剛加入酸時，可以看見有少量的溴 生成，當固體被酸浸沒后，產生溴的速度減慢。加完酸后，將冰浴撤去，讓反應體系恢復到室 溫，待固體完全被酸浸透后，開始用磁子攪拌，可見有部分溴生成。緩慢地加熱至85°C左右 反應8小時，反應時可見有大量的溴回流，溶液呈紅色透明狀本文檔來自技高網...
【技術保護點】
不同烷基鏈長的雙核釕配合物能夠用于靶向定位于細胞中的溶酶體，用作活細胞的溶酶體熒光探針。所述雙核釕配合物由陽離子部分和陰離子部分組成，其中，陽離子部分為不同烷基鏈長(n為大于等于1的正整數)的橋聯的雙核釕陽離子，陰離子部分為如ClO4?等無機鹽陰離子，其結構如下式所示：
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王克志，劉平，吳寶燕，張玉琦，
申請(專利權)人：北京師范大學，
類型：發明
國別省市：北京;11
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。