一種細胞溶酶體定位用熒光染料及其制備方法和應用技術

本發明專利技術公開了一種細胞溶酶體定位用熒光染料及其制備方法和應用。熒光染料化合物的制備方法是先將含甲基取代基的二苯酮衍生物在Zn/TiCl4催化下反應，得產物與N-溴代琥珀酰亞胺發生溴代反應后，再與嗎啡啉反應，得到含嗎啡啉基團的四苯乙烯衍生物染料。該制備方法操作簡單，原料易得，反應條件溫和。所得熒光染料含有聚集誘導熒光發射活性的四苯乙烯熒光基團，可用于對各類細胞溶酶體進行特異性染色。該熒光染料具有細胞毒性小、抗細胞代謝的穩定性及抗光漂白效果好等優點，且對細胞正常生理活動產生的影響很小，為長時間觀察細胞溶酶體形態變化提供了一種新的方法。該熒光染料可廣泛應用于監控細胞溶酶體形態、觀測細胞凋亡過程等方面。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，屬于生物分析 檢測

技術介紹
溶酶體是細胞中重要的細胞器，發揮著胞內物質分解代謝、免疫識別、免疫防御等 重要功能，同時，溶酶體在細胞凋亡過程中也扮演著重要角色。因此，對細胞中溶酶體的定 位、追蹤及形態觀察對了解整個細胞的生命過程具有重要的意義。 對溶酶體的成像通常采用熒光靶向成像的方法。目前已商業化的溶酶體靶向熒光染料包括LysoTrackei<? Red DND、LysoTracker Green DND-26、Lyso-Tracker Blue等。這些焚光染料對溶酶體具有革巴 向作用，能定位于細胞中的溶酶體。然而此類熒光染料由于處于溶液狀態，通常面臨著易于 發生光漂白、生物毒性大、抗生物代謝能力低等問題。特別是溶酶體內部復雜的環境，如含 有大量高活性酶和較低的pH環境等會導致染料結構的破壞。另一類溶酶體染色方法是采 用量子點熒光成像，但是由于目 前大多數量子點，如CdS含有重金屬，具有生物毒性，且量子點的表面性質改變可能導致熒 光淬滅，亦限制了量子點在熒光成像方面的應用。因此，亟待開發具有良好的生物相容性、 高的光穩定性及抗酶解代謝、且可長時間穩定定位于溶酶體的熒光染料。 目前已報道的溶酶體靶向熒光染料均為溶液狀態下進行細胞染色。當有機小分子在水 相中自組裝為膠體微粒后，可有效提高染料分子對酶解代謝的耐受性及光穩定性。四苯乙 烯基團具有聚集誘導熒光發射（AIE)活性，使得其組裝膠體微粒具有較強的熒光發射性能。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是在于提供一種抗光漂白且生物相容性好，且具有聚集誘導熒 光發射（AIE)活性的四苯乙烯熒光基團的溶酶體靶向熒光染料化合物。 本專利技術的目的之二是在于提供反應條件溫和、操作簡單、低成本制備所述熒光染 料化合物的方法。 本專利技術的目的之三是在于提供所述熒光染料分子應用于活體細胞中溶酶體的特 異性染色。該熒光染料分子具有抗光漂白效果好、生物相容性高、抗酶解能力強、溶酶體靶 向性高、可長時間監控活體細胞內溶酶體形態變化等優點。 本專利技術提供了一種熒光染料化合物，該熒光染料化合物具有式1所示結構： 其中，&、R2、私和R 4各自獨立地選自具有式2結構的基團、Η原子、甲基、F原子或 甲氧基中的一種，且札、R2、私和R 4中至少有一個選自具有式2結構的基團。 優選的焚光染料分子具有式3所不結構： 本專利技術提供了熒光染料分子的制備方法，將具有式4結構和式5結構的二苯酮衍 生物在Zn/TiCl4催化下反應，得到具有式6結構的1，1，2, 2-四苯乙烯衍生物；所得1，1，2， 2-四苯乙烯衍生物與N-溴代琥珀酰亞胺（NBS)發生溴化反應，反應產物再與嗎啡啉反應， 得到具有式1結構的含嗎啡啉基團的四苯乙烯衍生物。 其中，馬、1?6、1?7和1?8各自獨立地選自！1原子、甲基』原子或甲氧基中的一種，1? 5、 R6、馬和R s中至少有一個選自甲基。 本專利技術的熒光探針分子的制備方法還包括以下優選方案： 優選的1?5、1?6為和1?8基團為甲基或11原子且至少包含一個甲基；最優選為含有兩 個甲基。 優選的制備方法中具有式4結構和式5結構的二苯酮衍生物在四氫呋喃中回流 6 ~10h〇 優選的制備方法中所述的1，1，2, 2-四苯乙烯衍生物和N-溴代琥珀酰亞胺在四氯 化碳中回流反應6~8h。 優選的制備方法中所述的1，1，2, 2-四苯乙烯芐溴衍生物與嗎啡啉在1，4-二氧六 環中回流l-3h。 本專利技術還提供了熒光染料的應用，該應用是將熒光染料應用于活細胞的溶酶體靶 向熒光成像。 優選的應用方法，用少量水溶性有機溶劑將熒光染料溶解后，然后加入到細胞培 養液中得到含有熒光染料的染色液，移至貼壁活細胞培養體系中進行染色。 優選的應用方法中所述的水溶性有機溶劑包括丙酮、四氫呋喃、二甲基亞砜、乙 腈、丙酮等，最優選溶劑為二甲基亞砜。 優選的應用方法中所述的活細胞為各類貼壁腫瘤細胞系及正常細胞系。 所述的染色時間可以自0· 5~24h之間。 本專利技術的熒光染料化合物合成路線如下（以具有式3結構的熒光探針分子的合成 為例）： 本專利技術的熒光染料化合物由4,4' -二取代基二苯甲酮衍生物構建四苯乙烯熒光 骨架，并引入嗎啡啉結構單元作為溶酶體靶向基團。本專利技術的熒光染料化合物靶向溶酶體 的機理是：該類熒光染料分子中的嗎啡啉結構單元具有弱堿性（見圖1)，細胞內溶酶體pH 一般低于6. 0,因此在pH梯度的推動下，染料分子可以在溶酶體內大量富集，從而達到靶向 成像效果。 本專利技術的有益效果： 本專利技術的熒光染料化合物的制備方法操作簡單，原料易得，反應條件溫和。 本專利技術的熒光染料化合物化學性質穩定，細胞毒性低，抗光漂白效果好、對溶酶體 定位能力強。 本專利技術的熒光染料分子在細胞培養基中能夠組裝為膠體微粒，可有效提高染料對 細胞內各類酶的耐受性，使得這種聚集狀態的染料分子能夠較長時間存在于細胞內，因此 可以從0. 5~24h超長時間內實現對活細胞溶酶體形態變化的連續觀測。 本專利技術的熒光染料分子在水溶液中組裝為膠體狀態，同時于400~600nm波段產 生強熒光發射信號。在含有該類染料的培養基中培養細胞0. 5~24h后，即可在熒光顯微 鏡下觀測到明顯的細胞內熒光。本專利技術的熒光染料化合物基本細胞毒性很小，在正常染色 濃度下處理細胞1~48h，細胞存活率高于80 %。應用于細胞成像時，其抗光漂白效果優于 目前已商品化的溶酶體靶向染料，經一定時間激發光掃描后，信號損失少于25%，而作為對 比的商品化染料LysoTrackei?Red DND，其信號損失超過70%。該類熒光染料化合物在細 胞溶酶體形態長時間監控、細胞生理過程中溶酶體形態變化的觀測等領域具有廣泛的應用 前景。【附圖說明】 為實施例1制得熒光染料的pH-熒光強度關系圖。檢測體系為檸檬酸-磷 酸氫二鈉緩沖液（l〇〇mmol/L)。 為實施例1制得的熒光染料對L929細胞的毒性測試：采用MTT方法計算 含有不同濃度染料的培養基培養不同時間后的細胞存活率。橫坐標為染料的濃度（μmol/ L) 〇 為實施例1制得的熒光染料對MCF-7細胞的毒性測試：采用ΜΤΤ方法計算 含有不同濃度染料的培養基培養不同時間后的細胞存活率。橫坐標為染料的濃度（μmol/ L) 為實施例1制得的熒光染料與商品化溶酶體靶向染料LysoTracker? Red DND對L929細胞共染色實驗。藍色通道Chi為實施例1所得染料的熒光信號，紅色通道Ch2 為LysoTracker? Red DND熒光信號。右側圖片為細胞成像圖中劃線部分的Chi及Ch2通 道熒光強度-位置關系圖。 為實施例1所得熒光染料與商品化溶酶體靶向染料LysoTracker? Red DND 對L929細胞共染色后的光穩定性測試。左側四張圖片為初始狀態下的熒光強度及疊加圖， 右側四張為掃描6. 5min后，各通道的熒光強度及疊加圖。 為實施例1制得的熒光染料與商品化溶酶體靶向染料LysoTracker? Red DND信號強度-掃描時間關系圖。圖中信號初始狀態強度已進行歸一化。 為實施例1制得的熒光染料對L929細胞凋亡過程中溶酶體形態變化的觀 測圖。在含有10 μ mol/L染料分本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種溶酶體定位用熒光染料，其特征在于，具有式1所示結構：其中，R1、R2、R3和R4各自獨立地選自具有式2結構的基團、H原子、甲基、F原子或甲氧基中的一種，且R1、R2、R3和R4中至少有一個選自具有式2結構的基團。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉又年，臧啟光，王立強，鄧留，李娟，
申請(專利權)人：中南大學，
類型：發明
國別省市：湖南;43