一種檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針，是由香豆素?zé)晒鈭F(tuán)作為供體，半川菁熒光團(tuán)作為受體，通過哌嗪聯(lián)接構(gòu)筑成基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)機(jī)理檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針，該比率熒光探針化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(I)所示。實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)無硫化氫存在時(shí)，由于FRET打開，本發(fā)明專利技術(shù)的探針發(fā)射半川菁部分的紅熒光；當(dāng)硫化氫存在時(shí)，半川菁與硫化氫發(fā)生親核加成反應(yīng)，F(xiàn)RET受到抑制，探針發(fā)出香豆素部分的藍(lán)熒光，實(shí)現(xiàn)“比率計(jì)型”的熒光響應(yīng)，并具有操作簡(jiǎn)便，響應(yīng)靈敏等優(yōu)點(diǎn)。預(yù)示該探針在檢測(cè)含硫化氫樣品是含外源性硫化氫或內(nèi)源性硫化氫的生物細(xì)胞，或是含硫化氫的溶液中以及在細(xì)胞內(nèi)的線粒體定位中具有廣闊的應(yīng)用前景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針及其應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及一種硫化氫熒光探針，尤其涉及一種檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針及其應(yīng)用；屬于有機(jī)小分子熒光探針領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
硫化氫(H2S)作為內(nèi)源性氣體傳感信號(hào)分子的一種，充當(dāng)抗氧化劑和活性氧的清除劑。然而，硫化氫濃度異常會(huì)引起許多疾病，例如，阿爾茨海默病，唐氏綜合癥和糖尿病等。因此，定量檢測(cè)生物系統(tǒng)中的硫化氫引起廣泛的關(guān)注。熒光檢測(cè)法具有操作方便，靈敏度高，選擇性強(qiáng)，并能實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品的實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)等特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。然而，已報(bào)道的硫化氫探針大多是熒光“關(guān)-開”型(參見X.Li,S.Zhang,J.Cao,N.Xie,T.Liu,B.Yang,Q.-J.HeandY.-Z.Hu,AnICT-basedfluorescentswitch-onprobeforhydrogensulfideinlivingcells,Chem.Commun.,2013,49:8656—8658；Z.-J.Huang,S.-S.Ding,D.-H.Yu,F.-H.HuangandG.-Q.Feng,Aldehydegroupassistedthiolysisofdinitrophenylether:anewpromisingapproachforefficienthydrogensulfideprobes,Chem.Commun.,2014,50:9185-9187；X.-Y.Qu,C.-J.Li,H.-C.Chen,J.Mack,Z.-J.GuoandZ.Shen)，易受到檢測(cè)環(huán)境，如檢測(cè)溫度、探針濃度等條件的影響(K.Komatsu,Y.Urano,H.KojimaandT.Nagano,DevelopmentofanIminocoumarin-BasedZincSensorSuitableforRatiometricFluorescenceImagingofNeuronalZinc,J.Am.Chem.Soc.,2007,129:13447-13454)。然而，比率型熒光探針可以有效解決以上問題。因此，開發(fā)具有細(xì)胞成像能力，而且可以比率檢測(cè)硫化氫的熒光探針成為目前亟待解決的課題。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是設(shè)計(jì)比率熒光探針的一種重要檢測(cè)機(jī)理。FRET過程需要兩個(gè)條件：1、供體的發(fā)射譜與受體的吸收譜有足夠的重疊，2、供體和受體之間有合適的距離(約10-100)。香豆素?zé)晒鈭F(tuán)本身具有較大的量子產(chǎn)率，適合作為熒光供體，半川菁熒光團(tuán)具有吸收和發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)的特點(diǎn)，適合作為熒光受體。另外，哌嗪作為供體和受體之間的連接基團(tuán)在基于FRET機(jī)理的探針中獲得應(yīng)用。然而，如何選擇供體和受體，使FRET效率更高，如何提高對(duì)識(shí)別分子的選擇性、靈敏性以及改善其他應(yīng)用性能(如響應(yīng)時(shí)間、穩(wěn)定性、透膜性、低毒性等)，目前尚無規(guī)律可循。基于此，有關(guān)基于FRET機(jī)理檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針及其應(yīng)用還未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)要解決的問題是提供一種基于FRET機(jī)理檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針及其應(yīng)用。本專利技術(shù)的核心在于利用香豆素作為能量供體，半川菁作為能量受體構(gòu)筑FRET體系，這尚屬首次。當(dāng)用香豆素部分的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)探針的時(shí)候，由于FRET打開，探針發(fā)射半川菁部分的熒光；當(dāng)硫化氫存在的時(shí)候，半川菁與硫化氫發(fā)生親核加成反應(yīng)，半川菁熒光團(tuán)共軛體系斷裂，這時(shí)FRET受到抑制，再用相同激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)探針的時(shí)候，探針會(huì)發(fā)出香豆素部分的熒光。通過上述方案，實(shí)現(xiàn)“比率計(jì)型”的熒光響應(yīng)，使探針的靈敏度得到大幅度提高。本專利技術(shù)所述的檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針，其特征在于：所述比率熒光探針是由香豆素?zé)晒鈭F(tuán)作為供體，半川菁熒光團(tuán)作為受體，通過哌嗪聯(lián)接構(gòu)筑成基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)機(jī)理檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針，該比率熒光探針化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(I)所示(簡(jiǎn)稱CPC)：上述檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針(式(I)所示化合物)的制備方法，步驟如下：步驟1：由已知方法合成4-哌嗪基苯甲醛和7-二乙胺基-3-香豆素酰氯，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，二者加入到干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺，反應(yīng)得到式(II)所示化合物。步驟2：在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，式(II)所示化合物與1,2,3,3-四甲基吲哚碘化鹽在乙醇中回流即得到式(I)所示化合物。本專利技術(shù)所述的探針自身發(fā)紅色熒光，當(dāng)硫化氫存在的時(shí)候，探針與其發(fā)生親核加成反應(yīng)，抑制FRET進(jìn)程，從而達(dá)到比率檢測(cè)的效果。加成產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示。本專利技術(shù)所述檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針在檢測(cè)含硫化氫樣品中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中：所述含硫化氫樣品優(yōu)選是含外源性硫化氫或內(nèi)源性硫化氫的生物細(xì)胞，或是含硫化氫的溶液。其中所述生物細(xì)胞優(yōu)選是HeLa細(xì)胞。具體的：配制檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針(CPC)的PBS緩沖液(0.2M,pH＝7.4)的溶液，分別加入定量的H2S和Cl-,CH3CO2-,N2H4,SO32-,Br-,HCO3-,SO42-,EDA,CH3NH2,CO(NH2)2,CS(NH2)2,H2O2,NH3.H2O,I-,HClO,GSH,Hcy,Cys,NO,O2-,K+,Na+,Ca2+的水溶液。通過紫外可見分光光度法和熒光分光光度法測(cè)試其對(duì)不同硫醇、常見陰陽離子的選擇性和響應(yīng)能力。結(jié)果顯示探針對(duì)硫化氫有很好的選擇性，兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)相差113nm，具有非常好的比率響應(yīng)。見圖2，3。配制檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針(CPC)的PBS緩沖液(0.2M,pH＝7.4)的溶液，向其加入硫化氫且硫化氫的濃度依次遞增，如圖4所示，探針在587nm處的熒光逐漸減弱，在474nm處的熒光逐漸增強(qiáng)。探針對(duì)硫化氫的響應(yīng)非常靈敏，檢測(cè)限為40nM，如圖5所示。在加入3.0μM的熒光探針CPC的HeLa細(xì)胞中不加入或加入硫化氫，觀察細(xì)胞熒光顯微成像變化。熒光成像顯示：探針滲透進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，并隨著硫化氫濃度增加，紅色熒光逐漸減弱，相應(yīng)地，藍(lán)色熒光逐漸增強(qiáng)，見圖6。在加入2.0μM的熒光探針CPC的HeLa細(xì)胞中不加入或加入半胱氨酸，觀察細(xì)胞熒光顯微成像變化。熒光成像顯示：加入半胱氨酸的一組，紅光明顯減弱，藍(lán)光有所增強(qiáng)，見圖7。本專利技術(shù)所述檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針在細(xì)胞內(nèi)的線粒體定位中的應(yīng)用。在加入3.0μM的熒光探針CPC的HeLa細(xì)胞中繼續(xù)加入0.3μM線粒體紅，進(jìn)行共聚焦成像。熒光成像顯示：a組收集藍(lán)光部分，c組收集紅光部分，如圖8所示，預(yù)示本專利技術(shù)的探針可以進(jìn)行線粒體定位。本專利技術(shù)提供的硫化氫比率熒光探針可以選擇性地與硫化氫作用，具有熒光比率響應(yīng)效應(yīng)、選擇性強(qiáng)、不受生物硫醇的干擾、靈敏度高、響應(yīng)快速等優(yōu)點(diǎn)。可以比率檢測(cè)硫化氫，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的外源性和內(nèi)源性硫化氫比率成像，另外探針可以進(jìn)行線粒體定位，有望在生物科學(xué)中發(fā)揮作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。本專利技術(shù)具有如下特點(diǎn)：1)本專利技術(shù)提供的熒光探針對(duì)硫化氫選擇性專一，而且成比例檢測(cè)。2)本專利技術(shù)提供的熒光探針是新型的FRET比例探針。3)本專利技術(shù)提供的熒光探針對(duì)硫化氫靈敏度高，檢測(cè)限為40nM。4)本專利技術(shù)提供的熒光探針對(duì)硫化氫響應(yīng)快速。5)本專利技術(shù)提供的熒光探針可以檢測(cè)HeLa細(xì)胞中的外源性和內(nèi)源性硫化氫。6)本專利技術(shù)提供的熒光探針可以定位線粒體檢測(cè)硫化氫。附圖說明圖1為熒光探針CPC與硫化氫加成產(chǎn)物的LCQFlee本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針，其特征在于：所述比率熒光探針是由香豆素?zé)晒鈭F(tuán)作為供體，半川菁熒光團(tuán)作為受體，通過哌嗪聯(lián)接構(gòu)筑成基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)機(jī)理檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針，該比率熒光探針化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針，其特征在于：所述比率熒光探針是由香豆素?zé)晒鈭F(tuán)作為供體，半川菁熒光團(tuán)作為受體，通過哌嗪聯(lián)接構(gòu)筑成基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)機(jī)理檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針，該比率熒光探針化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：2.權(quán)利要求1所述檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針在檢測(cè)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙寶祥，苗俊英，馮笑，張濤，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：山東大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東;37