本發(fā)明專利技術公開了一種重組人胰島素前體的純化和酶切轉換方法，屬于重組人胰島素及其類似物的制備領域。本發(fā)明專利技術將分泌表達的重組人胰島素前體的發(fā)酵上清用陽離子層析柱進行純化，在層析的洗滌時先后采用兩種不同洗滌液進行洗滌，更快速的進行目的蛋白的洗脫，縮短洗脫時間，減少目的蛋白沉淀，同時減少洗脫樣品體積；在洗脫時采用pH值7.0-9.0的洗脫液進行洗脫，洗脫后的產物不需進行換相操作，直接加入胰蛋白酶進行酶切轉換，轉換效率高。本發(fā)明專利技術方法操作簡單，經過一步離子層析純化完成對發(fā)酵液上清的粗純化和換相操作，能夠將樣品純度從14％提高至95％，且純化后的樣品直接進行酶切，酶切轉換效率在95％以上，簡化生產工藝，節(jié)約成本。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種，屬于重組人胰島素的 制備領域。
技術介紹
糖尿病已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤后的第三大威脅人類健康的慢性非傳染 性疾病。目前，中國糖尿病患病人數已取代印度成為世界第一，世界衛(wèi)生組織（WHO)預測至 2025年全球糖尿病人數將突破3. 0億。 胰島素制品是最有效的糖尿病治療藥物之一。隨著科學技術的發(fā)展，從提取動物 胰島素到有機合成胰島素、半合成人胰島素，到現如今占主要市場的重組人胰島素，胰島素 的工業(yè)化生產過程已經歷了翻天覆地的變化。重組胰島素前體分為包涵體和分泌蛋白兩種 形式，分泌蛋白常使用陽離子層析柱，但在樣品進行離子純化前需要初步純化，如中國專利 CN1854299A中提到，胰島素前體在離子層析純化前需要經過鹽析或微濾步驟進行初步純 化，樣品處理程序復雜，操作繁瑣，且工藝步驟的增多必然會導致樣品收率的降低。 因此，開發(fā)一種新的，使純化后的重組 胰島素前體直接進行酶切，簡化生產工藝，將具有重要的市場價值和應用前景。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種重組人胰島素前體的純化和酶切轉換方 法，該方法經過一步離子層析純化，能夠將重組胰島素前體純度從14%提高至95%，且純 化后的樣品可直接進行酶切，酶切轉換效率在95%以上，簡化了生產工藝，節(jié)約純化成本。 為解決上述技術問題，本專利技術所采取的技術方案是： 本專利技術公開了一種，包括：（1)將陽離 子離子層析柱用平衡液進行平衡；（2)將分泌表達的重組人胰島素前體的發(fā)酵上清上平衡 后的陽離子離子層析柱，依次用平衡液進行平衡、用洗滌液進行洗滌和用洗脫液進行洗脫； 收集洗脫產物，得到純化的重組人胰島素前體；（3)將純化的重組人胰島素前體用胰蛋白 酶進行酶切轉換，得到缺少B鏈第30位蘇氨酸的人胰島素；其中，所述洗脫液的pH值為 7. 0-9. 0,優(yōu)選為 7. 8-8. 5,更優(yōu)選為 8. 0-8. 5。 其中，所述洗脫液為碳酸氫銨緩沖液、硼酸緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液中 的任意一種。洗脫液的濃度為0. 05-0. 3mol/L;優(yōu)選的，所述洗脫液的濃度為0. 1-0. 15mol/ L〇 步驟（2)中所述洗滌過程分為兩步，即先用洗滌液A進行洗滌，然后再用洗滌液B 進行洗滌；所述洗滌液A包括：緩沖液和無機鹽；其中，所述緩沖液為磷酸緩沖液、乙酸緩沖 液、檸檬酸緩沖液或琥珀酸緩沖液中的任意一種；所述無機鹽為氯化鈉；優(yōu)選的，所述緩沖 液的濃度為〇? 01-0. 2mol/L，優(yōu)選為0? 01-0. 05mol/L，最優(yōu)選為20mmol/L;所述無機鹽的濃 度為0? 01-0. 2mol/L，優(yōu)選為0? 01-0. 12mol/L，最優(yōu)選為0?lmol/L。具體的，所述洗滌液A 包括：20mmol/L梓檬酸+0?lmol/LNaCl;或者，所述洗滌液A包括：20mmol/L乙酸+0?lmol/LNaCl〇 步驟（2)中所述洗滌還包括：用洗滌液A洗滌后，再接著用洗滌液B洗滌陽離子層 析柱；所述洗滌液B為鹽酸；優(yōu)選的，所述洗滌液B為l-5mmol/L鹽酸；最優(yōu)選為5mmol/L鹽 酸。 本專利技術所述洗滌液A或洗滌液B的pH值為2. 0-4. 5,優(yōu)選為3. 0-4. 0,更優(yōu)選為 3. 5-4. 0,最優(yōu)選為4.0。 步驟（1)或步驟（2)中所述的平衡液包括：緩沖液和無機鹽；其中，所述緩沖液 為磷酸緩沖液、乙酸緩沖液、檸檬酸緩沖液或琥珀酸緩沖液中的任意一種或多種；所述無機 鹽為氯化鈉；優(yōu)選的，所述緩沖液的濃度為〇? 01-0. 2mol/L，優(yōu)選為0? 01-0. 05mol/L，最優(yōu) 選為20mmol/L;所述無機鹽的濃度為0? 01-0. 12mol/L，優(yōu)選為0? 01-0.lmol/L，最優(yōu)選為 0.01m〇l/L。具體的，所述平衡液包括：20mmol/L檸檬酸+0.01mol/LNaCl;或者，所述平衡 液包括：20mmol/L乙酸+0. 01mol/LNaCl。進一步優(yōu)選的，所述平衡液pH值為2. 0-4. 5,優(yōu) 選為3. 0-4. 0,更優(yōu)選為3. 5-4. 0,最優(yōu)選為4. 0。 本專利技術所述中，所述胰蛋白酶的加入量 為：按照質量比計，胰蛋白酶：重組人胰島素前體=1:100~1:400 ;優(yōu)選為1:200 ;所述酶 切的溫度為20-40°C;酶切的時間為0. 5-3小時；優(yōu)選的，所述酶切的溫度為25-30°C;酶切 的時間為1-1. 5小時；最優(yōu)選的，所述酶切的溫度為30°C;酶切的時間為1. 5小時。 本專利技術所述的分泌表達的重組人胰島素前體的發(fā)酵上清為編碼重組人胰島素前 體的基因在真核細胞中進行分泌表達獲得的發(fā)酵上清；優(yōu)選的，所述的分泌表達的重組人 胰島素前體的發(fā)酵上清為編碼重組人胰島素前體的基因在畢赤酵母（Pichiapastoris)細 胞中進行分泌表達獲得的發(fā)酵上清。所述重組人胰島素前體的氨基酸序列為SEQIDNO. 1 所示（參考《重組胰島素前體轉化成人胰島素和地特胰島素的工藝研究》，劉海峰，華東理 工大學，博士學位論文（2013))。此氨基酸序列包括間隔肽、缺30位的胰島素B鏈、小C肽和 胰島素A鏈四個部分，三個胰蛋白酶酶切位點：Sitel為間隔肽與B鏈之間，Site2和Site3 分別為小C肽兩端。其中間隔肽及小C肽的長短可以調節(jié)，酶切位點可以設計成其他酶的 酶切位點，A、B鏈可以是在此基礎上進行其他修飾，因此認為，以上提及的可修飾或微小變 化的序列改變都在本專利技術的保護范圍內。 本專利技術中根據高效液相檢測結果顯示，目的蛋白重組人胰島素前體在發(fā)酵上清中 純度約14% (發(fā)酵液液相檢測結果顯示有兩個較大的色素吸收峰，去除色素峰后純度在 70-80%，特此說明。但本專利技術中樣品均以高效液相檢測結果中未去除色素峰的純度進行統(tǒng) 計。），由于發(fā)酵上清中鹽濃度較高，需要稀釋后才能在上樣過程中使目的蛋白吸附在離子 層析介質上。重組人胰島素前體的生產方法在本領域內是已知的，例如，可以參考中國專利 CN1873006A中公開的方法。 本專利技術將分泌表達的重組人胰島素前體的發(fā)酵上清進行預處理后再上平衡后 的陽離子離子層析柱；其中，所述預處理包括：將發(fā)酵上清稀釋，加入緩沖劑，使發(fā)酵上清 與平衡液具有相同的緩沖鹽濃度和pH值；其中，所述緩沖劑為磷酸、乙酸、檸檬酸或琥珀 酸中的任意一種；所述緩沖鹽濃度為〇? 01-0. 2mol/L，優(yōu)選為0? 01-0. 05mol/L，最優(yōu)選為 20mmol/L;所述pH值為2. 0-4. 5,優(yōu)選為3. 0-4. 0,更優(yōu)選為3. 5-4. 0,最優(yōu)選為4. 0 ;所述稀 釋為稀釋5-20倍，優(yōu)選為稀釋10倍；用去離子水或注射用水進行稀釋。 本專利技術用鹽酸或氫氧化鈉中的任意一種調節(jié)平衡液、洗滌液A、洗滌液B、洗脫液 或發(fā)酵上清的pH值。 本專利技術方法中，離子層析采用AKTAexplorer100層析工作站，所用層析柱為 XK26/200 (裝填體積為50ml)。所述陽離子層析的離子交換填料為SS印haroseFF、SP SepharoseFF、CMSepharoseFF，Source15S或Source30S中的任意一種；優(yōu)選為CM S印haroseFF;所述陽離子層析柱的溫度為20-25本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種重組人胰島素前體的純化和酶切轉換方法，包括：(1)將陽離子離子層析柱用平衡液進行平衡；(2)將分泌表達的重組人胰島素前體的發(fā)酵上清上平衡后的陽離子離子層析柱，依次用平衡液進行平衡、用洗滌液進行洗滌和用洗脫液進行洗脫；收集洗脫產物，得到純化的重組人胰島素前體；(3)將純化的重組人胰島素前體用胰蛋白酶進行酶切轉換，得到缺少B鏈第30位蘇氨酸的人胰島素；其特征在于：所述洗脫液的pH值為7.0?9.0，優(yōu)選為7.8?8.5，更優(yōu)選為8.0?8.5。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：劉海峰，周祥山，應歡，張元興，田守生，解福生，方喆，黃菁，龐甲佩，史兆松，
申請(專利權)人：山東阿華生物藥業(yè)有限公司，東阿阿膠股份有限公司，華東理工大學，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37
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