本發明專利技術提供了一種用于轉基因水稻KF6、TT51、KMD1的定性和定量PCR檢測的重組標準質粒，由如下方法獲得：將SEQ?ID?No.1所示的KF6側翼序列、SEQ?ID?No.2所示的TT51側翼序列、SEQ?IDNo.3所示的KMD1側翼序列和SEQ?ID?No.4所示的PLD基因依次連接獲得融合片段，再將所得融合片段克隆到載體pMD18-T中，獲得所述重組標準質粒，記為pMD-KTK。該重組標準質粒可以替代轉基因水稻KF6、TT51和KMD1的陽性標準品，用于對轉基因水稻KF6、TT51、KMD1轉化體特異性定性和定量PCR檢測，具有特異性好、靈敏度高等優點，應用該重組標準質粒進行實際樣品定量分析時，樣品檢測結果的偏差在國際上廣泛認可的允許范圍內，很好地解決了轉基因水稻KF6、TT51、KMD1在檢測過程中陽性標準品匱乏的問題。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種用于三種轉基因水稻KF6、TT51、KMDl的定性和定量檢測的重組標準質粒，以及含有該重組標準質粒的試劑盒。
技術介紹
自首例轉基因番茄“FLAVR SAVR”于1994年在美國批準商業化生產以來，隨著轉基因技術迅速發展，許多有價值的外源基因導入了植物中，越來越多的轉基因作物被批準在不同國家和地區商業化種植。對水稻而言，目前有許多抗蟲、抗病、耐除草劑及營養成分改良的轉基因水稻研發成功，轉基因水稻品系:KF6、TT51和KMDl為我國擁有自主知識產權的抗蟲Bt水稻，其中轉基因抗蟲水稻華恢I號(TT51)在2009年，我國農業部頒發了其在湖北省生產應用的安全證書。為保障在農產品進出口貿易中的利益，各國相繼建立轉基因標識制度，對轉基因檢測技術的準確度和靈敏度提出了嚴格的要求，目前對轉基因作物及其產品的檢測主要有蛋白質水平檢測和核酸水平檢測，而由于核酸的提取、保存及穩定性等方面的優勢，使得基于核酸檢測的轉基因檢測技術得到快速發展，其中以聚合酶鏈式反應(PCR)技術發展得最快，轉基因作物PCR檢測方法又分為4個層次，分別為篩查檢測、基因檢測、構建特異性檢測和轉化體特異性檢測，在日常的檢測工作中，由于轉基因樣品量較大，轉基因的篩查工作顯得尤為重要，而陽性標準品的缺乏無法滿足轉基因安全監管中篩查工作的需求，因此開發一種針對轉基因水稻篩查檢測用質粒標準分子具有重要的意義。陽性質粒分子的概念由日本科學家Kuribara H等于2002年提出，它是指一種含有轉基因作物檢測的目的外源基因和內標準基因的特異性擴增片段的線性化的重組質粒分子。陽性質粒分子的優點主要是可以通過微生物進行大量培養，且操作容易，同一個陽性質粒分子可以同時包含多個外源目的基因，質粒DNA提取容易且純度較高。轉基因作物陽性質粒分子是轉基因標準物質 的一種。開發陽性質粒分子可以有效的解決檢測工作中缺乏有證標準物質和陽性材料的難題。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供本專利技術的目的是提供一種為三種轉基因水稻KF6(科豐6號)、TT51 (華恢I號)、KMD1 (克螟稻)的轉化體特異性檢測用重組標準質粒及其應用，滿足轉基因水稻安全監管篩查檢測工作中的需求。本專利技術采用的技術方案是:一種用于轉基因水稻KF6、TT51、KMDl的定性和定量PCR檢測的重組標準質粒，由如下方法獲得:將SEQ ID N0.1所示的KF6側翼序列、SEQ ID N0.2所示的TT51側翼序列、SEQ ID N0.3所示的KMDl側翼序列和SEQ ID N0.4所示的PLD基因依次連接獲得融合片段，再將所得融合片段克隆到載體PMD18-T中，獲得所述重組標準質粒，記為pMD-KTK。KF6側翼序列如下(長度454bp):GatcccgaaggccaacacaataggaccggaatcctatgatgttatcccatgctaatgtatccagagcgatggcttgctttgagcactctaatttcttcaaagtaacggcgccggaggcacgacccggccagttaaggccaggagcgcatctgatccaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttataggctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagcttgtcgatcgacagatcccggtcggcatctactctatttctttgccctcggacgaTT51側翼序列如下(長度305bp):CcggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaacccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgatttgtagagagagactggtgatttcagcgggcatgcctgcaggtcgactctagaggatcccggacgagtgctggggcagataagcagtagtggtggggctacgaacatattccttttccttctggacgctaccactcatatgttccaaaattacaaatttgtcctttgtatttgttgcaattttcatgtaagaaatccaacgaggctKMDl側翼序列如下(長度398bp):TgtggagcgtcaactgggagcttatcttattactaattagtattaccattgccattacgtctgaaacagacggggctcccatttctttttgatgtcgttagtacagccggcttcgtttttcttttctggctgtctcggctgtcacctgtcagtctcgtcagcaactggggtgttccgccgacgagggcgccgtggacttcgcgggctcgcggcgatggcgatgcgcgctccaactgcggcgggtctcaccgggctgcgtgcgtacgccgatatgcctgcccatctcgggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactggggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagcPLD基因序列如下(長度250bp):Agaccagaagacattgagccgttgcatctgattcccagagagatttctctgaagattgtgaacaagattgaagctggtgagcgttttgcag tctatgttgtgctgccaatgtggcctgaaggacctcctgctagtggatcagtgcaggcaatactggattggcagaggaggacaatggagatgatgtactatgatattgccgttgcacttgaggcgaagaggatcaatgctgacccgagggattacctta。本專利技術根據三個轉基因水稻KF6、TT51、KMDl的轉化體特異性序列及水稻內標基因PLD的序列，設計相應的引物，利用重疊PCR技術將四個序列片段融合在一起，再利用分子克隆技術將融合片段克隆到PMD18-T載體中，獲得質粒分子重組標準質粒pMD-KTK。具體的，所述融合片段核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示(長度1407bp):gatcccgaaggccaacacaataggaccggaatcctatgatgttatcccatgctaatgtatccagagcgatggcttgctttgagcactctaatttcttcaaagtaacggcgccggaggcacgacccggccagttaaggccaggagcgcatctgatccaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggat本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于轉基因水稻KF6、TT51、KMD1的定性和定量PCR檢測的重組標準質粒，由如下方法獲得：將SEQ?ID?No.1所示的KF6側翼序列、SEQ?ID?No.2所示的TT51側翼序列、SEQ?ID?No.3所示的KMD1側翼序列和SEQ?ID?No.4所示的PLD基因依次連接獲得融合片段，再將所得融合片段克隆到載體pMD18?T中，獲得所述重組標準質粒，記為pMD?KTK。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：徐俊鋒，陳笑蕓，汪小福，繆青梅，朱妍晴，朱青，
申請(專利權)人：浙江省農業科學院，
類型：發明
國別省市：
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