互花米草種群的SNP標(biāo)記的分型方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種互花米草種群的SNP標(biāo)記的分型方法，本方法根據(jù)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選得到目標(biāo)基因，通過PCR反應(yīng)、PCR產(chǎn)物測(cè)序得到多個(gè)SNP位點(diǎn)。再由所有有效的SNP位點(diǎn)組成單倍體型用于分子標(biāo)記以達(dá)到遺傳分型。本發(fā)明專利技術(shù)在一次實(shí)驗(yàn)中，即可得到豐富的多態(tài)性信息。SNP標(biāo)記遺傳穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便，適合用物種溯源。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，涉及一種基于SNP標(biāo)記的互花米草分子標(biāo)記篩選技術(shù)。
技術(shù)介紹
互花米草(Spartina alterniflora)是一種原產(chǎn)北美大西洋沿岸的多年生草本植物。因其促淤造陸和消浪護(hù)堤作用顯著而被許多國(guó)家引種。1979年，南京大學(xué)從美國(guó)東南部的北卡羅萊納、喬治亞和佛羅里達(dá)引種了 3種不同生態(tài)型互花米草至福建羅源灣，隨后擴(kuò)大分布至我國(guó)海岸潮間帶遼寧丹東以南的廣大區(qū)域，并取得了一定的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。但作為外來物種，其強(qiáng)大的繁殖能力和高大密集的種群特征，對(duì)我國(guó)沿海灘涂地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)、生物多樣性和水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)生了較大的負(fù)面影響，2003年被環(huán)保總局列入我國(guó)第一批16種外來入侵物種名單。如今中國(guó)已成為全球遭受外來物種入侵危害最嚴(yán)重的國(guó)家之一，已發(fā)現(xiàn)外來入侵物種488種，其中50余種位列世界自然保護(hù)聯(lián)盟公布的全球100種最具威脅外來物種，每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1200億元，治理投入更是難以估算。近年來入侵我國(guó)的外來生物更是呈現(xiàn)出傳入數(shù)量增多、傳入頻率加快、蔓延范圍擴(kuò)大、發(fā)生危害加劇、經(jīng)濟(jì)損失加重等趨勢(shì)。因此，生物入侵問題越來越受到世人的關(guān)注，包括其成因、危害及控制技術(shù)等諸多方面。但目前，大部分的研究主要集中在競(jìng)爭(zhēng)性排斥、生態(tài)位替代、生物學(xué)特性、化感、捕食、寄生等生態(tài)過程，缺乏對(duì)其種群溯源、快速適應(yīng)與進(jìn)化模式、快速入侵與擴(kuò)張動(dòng)力等入侵機(jī)制方面的理解。SNP標(biāo)記是美國(guó)學(xué)者Lander E于1996年提出的第三代DNA遺傳標(biāo)記。SNP是指同一位點(diǎn)的不同等位基因之間僅有個(gè)別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對(duì)單個(gè)核苷酸的差異進(jìn)行檢測(cè)，SNP標(biāo)記可幫助區(qū)分兩個(gè)個(gè)體遺傳物質(zhì)的差異。組成DNA的堿基雖然有4種，但SNP —般只有兩種堿基組成，所以它是一種二態(tài)的標(biāo)記，即二等位基因(biallelic)。由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/_的分析，而不用分析片段的長(zhǎng)度，這就利于發(fā)展自動(dòng)化技術(shù)篩選或檢測(cè)SNPs。從分子水平上對(duì)單個(gè)核苷酸的差異進(jìn)行檢測(cè)，SNP標(biāo)記可幫助區(qū)分個(gè)體間遺傳物質(zhì)的差異。隨著SNP標(biāo)記技術(shù)的成熟及其在分子生態(tài)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，外來物種種群溯源、入侵機(jī)理日益成為國(guó)際上研究的重點(diǎn)。大量的研究表明外來入侵種能在如此短的時(shí)間內(nèi)迅速地做出適應(yīng)性的進(jìn)化，可 能與其自身的遺傳結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。因而，在外來入侵物種上，亟需一種能夠有效揭示外來入侵物種遺傳本質(zhì)的方法。本專利技術(shù)以互花米草為對(duì)象，在整個(gè)基因組內(nèi)批量尋找多態(tài)性位點(diǎn)，全面評(píng)估互花米草的多樣性，建立一種基于SNP標(biāo)記的互花米草種群溯源方法，為進(jìn)一步研究和控制互花米草等相關(guān)物種提供有力的技術(shù)支持。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種基于SNP標(biāo)記的互花米草種群溯源方法，能夠在基因組序列信息較少的情況下，獲得大量的核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)引入的不同互花米草種群之間存在的遺傳變異，為揭示其遺傳本質(zhì)和入侵機(jī)制，進(jìn)一步研究和控制互花米草提供有力的技術(shù)支持。本專利技術(shù)的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標(biāo)記方法，步驟如下:1)種群調(diào)查及取樣；2) DNA 提取；3)測(cè)序；4)篩選目標(biāo)基因R71;5)根據(jù)目標(biāo)基因R71設(shè)計(jì)引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ IDNO:2所示；6) PCR 擴(kuò)增；7)測(cè)序；8)序列拼接、比對(duì)，鑒定記錄單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。進(jìn)一步地，所述目標(biāo)基因R71是通過高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后篩選得到。進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C 30s、54°C 30s、72°C 1.5min,39 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin0進(jìn)一步地，所述目標(biāo)基因R71在互花米草種群中有8個(gè)SNP位點(diǎn)，目標(biāo)基因R71基因片段如序列表中SEQ ID勵(lì):3所示，其中8個(gè)5冊(cè)位點(diǎn)分別位于73、117、135、179、224、230、254、616。進(jìn)一步地，高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法:提取樣本總RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分離mRNA,合成雙鏈cDNA,構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫,插入片段長(zhǎng)度約為500bp,在illuminaHiSeq2000測(cè)序儀上進(jìn)行高通量測(cè)序，使用Trinity軟件對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行拼接，從而得到基因序列。本專利技術(shù)的有益效果:包括互花米草在內(nèi)的許多物種為非模式植物，基因組龐大，很多物種缺少全基因組數(shù)據(jù)，在進(jìn)行傳統(tǒng)的各種傳統(tǒng)分子標(biāo)記分析時(shí)，如RAPD、SSR、AFLP,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性較差，假陽性率偏高。而且，傳統(tǒng)分子標(biāo)記一次實(shí)驗(yàn)只能找到少量多態(tài)性位點(diǎn)信息，如果需要高精度的分辨率，需要多次實(shí)驗(yàn)。本專利技術(shù)在一次實(shí)驗(yàn)中，即可得到8個(gè)SNP位點(diǎn)，提供豐富的多態(tài)性信息。同時(shí)，本專利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單，成功率高，可重復(fù)性好。在實(shí)施過程中，實(shí)驗(yàn)成功率在98%以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性更達(dá)到100%。本專利技術(shù)采用的8個(gè)SNP位點(diǎn)，單倍體基因型理論上可以達(dá)到2的8次方，即256，能夠提供非常豐富的多態(tài)性信息，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。SNP標(biāo)記遺傳穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便，適合用物種溯源。具體實(shí)施方式:下面結(jié)合具體樣本對(duì)本專利技術(shù)做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本專利技術(shù)的解釋而不是限定。1.種群調(diào)查及取樣選擇上海崇明島和天津塘沽海河沿岸為采樣點(diǎn)，選取生長(zhǎng)良好、無蟲害的葉片，采下后立刻放入事先準(zhǔn)備好的裝有約半袋硅膠的自封袋里，混勻使葉片與硅膠充分混合，以便快速脫水。帶回實(shí)驗(yàn)室后根據(jù)實(shí)際情況更換已經(jīng)變色的硅膠，干燥之后待提取DNA用。每一采樣點(diǎn)隨機(jī)取樣30株左右，個(gè)體間的間距不小于50米，以盡可能避免重復(fù)采集同一克隆，記錄每一樣本的編號(hào)、生境、地理參數(shù)(經(jīng)緯度)、樣品高度，樣品直徑等詳細(xì)信息。2.DNA 提取使用BioFlux公司的Biospin植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，具體步驟稍作調(diào)整:(I)稱取0.07-0.1g干葉，用剪刀剪碎；用液氮冷凍研缽、研棒，將材料倒入盛有液氮的研缽中，用力磨成粉末，在研磨過程中注意不要讓材料反復(fù)凍融。(2)將研磨好的粉末用勺小心地轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入450uL LP Buffer的2.0ml離心管中，混合均勻。(3)65°C金屬浴中溫浴30-60分鐘(溫浴過程中間隔振蕩2_3次)，然后移出。(4)加入150uL DA Buffer，混合均勻后于冰浴中放置5分鐘。(5)于13，OOOrpm離心10分鐘，再將上清液轉(zhuǎn)移至Shredder spin column中,13, OOOrpm離心I分鐘。(6)將濾液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml離心管中。(7)加入濾液體積1.5倍的P Binding Buffer,輕柔的混合均勻，管中出現(xiàn)絮狀沉淀，13, OOOrpm離心10分鐘。(8)將上清液轉(zhuǎn)移至Spin column。于7，500rpm離心一分鐘,并棄去接液管中液 體。(9)向 Spin column 中加入 500uL 的 G Binding Buffer。12, OOOrpm 離心 30 秒，并棄去接液管中液體。(10)向 Spin column 中加入 600uL 的 Wash Buffer。12, OOOrpm 離心 30 秒，并棄去接液管中液體。(11)重復(fù)步驟10，一次。(12)再次將 Spin column 于 12，本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種互花米草種群的SNP標(biāo)記的分型方法，其特征在于，步驟如下：1)種群調(diào)查及取樣；2)DNA提取；3)測(cè)序；4)篩選種群的目標(biāo)基因R71；5)根據(jù)目標(biāo)基因R71設(shè)計(jì)引物，正向引物如序列表中SEQ?ID?NO：1所示；反向引物如序列表中SEQ?IDNO：2所示；6)PCR擴(kuò)增；7)測(cè)序；8)序列拼接、比對(duì)，鑒定記錄單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳建群，丁靜，王強(qiáng)，許穎，吳娟子，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：