一種改造重組酶Cre的方法及其在植物中的應用，它涉及將重組蛋白Cre拆分為無活性的N端（NCre）和C端（CCre）兩部分，并且對拆分蛋白進行體外原核表達和活性檢測，同時分別構建新的Cre/loxp系統(tǒng)，將其應用于植物當中，實現了當N端和C端在同一個植物細胞時恢復重組活性而發(fā)生刪除，反之則不能。本發(fā)明專利技術還包括核定位信號NLS對該系統(tǒng)的影響以及所有的植物表達載體和體外原核表達載體。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學領域中的植物基因工程領域，涉及對重組酶Cre進行拆分，構建新的Cre/loxp系統(tǒng)的方法及應用。
技術介紹
在農業(yè)生產實踐中，植物轉基因技術應用非常廣泛，該技術在改良作物品質，提高作物產量，減少除草劑、殺蟲劑等農藥的使用量等方面做出了巨大貢獻。轉基因技術給我們帶來巨大的經濟利益和生態(tài)效益的同時，由于該技術不斷發(fā)展突破并且開發(fā)利用的時間尚短，轉基因植物在生態(tài)環(huán)境和食品安全等方面引起的質疑越來越多，賈士榮等認為目前人類還不能對該技術帶來的潛在危險性做出正確評價，其主要原因是轉基因植物當中的一些外源的選擇標記基因的存在。Goldsbrough等采用轉座子技術、Komari等采用共轉化技術去除轉基因植物中的選擇標記基因，而應用最早、最廣泛、最深入的是位點特異性系統(tǒng)中的Cre/loxp 系統(tǒng)。 Cre/loxp系統(tǒng)廣泛應用于動物、植物和酵母等生物體中，尤其在小鼠當中的研究最為深入。Gilbertson等認為Cre/loxp系統(tǒng)是植物生物
中切除轉基因植物染色體上外源基因的重要工具。Sauer等早在1987年將該系統(tǒng)應用于釀酒酵母，首次證明了來自原核細胞的Cre重組酶在真核細胞中也會發(fā)生基因敲除。Luo等采用組織特異性啟動子Bgp啟動重組酶的表達，在植物體特定的器官(種子或者花粉)中達到對外源標記基因的刪除。但是特異性的啟動子只能控制重組酶基因在特定部位的表達，從而大大限制了 Cre/1xp系統(tǒng)的應用范圍。蛋白-蛋白之間的相互作用對調控細胞生長等程序性的活動扮演著重要的角色，一些技術被用來檢測活細胞當中蛋白-蛋白之間的相互作用。Yukichi等將螢光素酶拆分為無活性的N端和C端，分別與組蛋白H2A和H2B融合，轉化擬南芥原生質體后檢測到熒光素酶活性。Yang等在2003年將GUS報告基因拆分后轉化擬南芥，利用內含肽介導的蛋白互補技術在轉基因植物當中恢復了 GUS基因的酶活。大量研究表明，將一個完整的蛋白拆分為沒有活性的兩部分，通過借助一對相關的蛋白輔助因子，在兩部分分別融合其中的一個輔助因子，進而達到蛋白質的重建和活性的恢復。本專利技術對Cre/loxp系統(tǒng)中的重要元件重組酶Cre進行直接拆分，將其拆分為無活性的N端和C端，將這兩部分共同轉化煙草發(fā)根，實現當這兩部分在同一個植物細胞當中時，恢復了重組酶的活性而發(fā)生基因刪除，反之將任何一部分單獨轉化，該系統(tǒng)均不具有刪除活性。采用該技術對Cre/loxp系統(tǒng)進行改造之后，不僅可以獲得沒有活性的Cre/loxp系統(tǒng)，同時又可以根據需要使其在轉基因植物當中恢復活性，增加了 Cre/loxp系統(tǒng)的可控性和應用范圍。本專利技術在植物當中的應用從未見報道。
技術實現思路
為了解決上述問題，本專利技術的目的在于提供一種改造重組酶Cre的方法，并將其應用于植物當中。本專利技術中，所述的方法是利用蛋白拆分技術將重組蛋白Cre在第59和60個氨基酸之間直接拆分為無活性的N端(NCre)和C端(CCre)兩部分，對拆分蛋白進行重組活性檢測。在本專利技術的一個具體實施方案中，將NCre和CCre構建到原核表達載體pMAL_C2X上，誘導表達純化之后，體外檢測拆分蛋白的活性。本專利技術中，將含有一對同向識別位點1xp的融合基因loxP-nos-loxP構建于PCAMBIA1305.1上得到中間載體pCA-LoxP，以此載體為骨架將不同的拆分蛋白構建上去，得到本專利技術的含有Cre/loxp系統(tǒng)的所有的植物表達載體。在本專利技術的另一個具體實施方案中，將所有的植物表達載體通過發(fā)根農桿菌介導的遺傳轉化轉化煙草，獲得煙草轉基因毛狀根，通過GUS組織染色和PCR分子檢測改造的Cre/loxp系統(tǒng)的重組活性。在本專利技術中，體外蛋白實驗證明拆分蛋白的NCre和CCre混合在一起的時候具有完整的Cre蛋白的活性。本專利技術中，將拆分蛋白NCre和CCre分別構建的Cre/loxp系統(tǒng)轉化煙草后發(fā)現當N端和C端(即NCre和CCre)在同一個植物細胞時恢復重組活性而發(fā)生刪除，反之則不能。這點與體外蛋白實驗結果 一致。附圖說明圖1:重組酶Cre拆分為N端(NCre)和C端(CCre)的模型以及各部分融合NLS。圖2:重組蛋白Cre以及拆分蛋白NCre、CCre的體外誘導表達、純化以及活性檢測結果。其中A:拆分蛋白NCre、CCre在含有麥芽糖結合蛋白標簽MBP的表達載體PMAL-C2X上的表達及純化和完整的重組蛋白Cre在pET_28a載體上的表達及純化(其中1，2，7分別為拆分蛋白NCre的誘導，未誘導，純化；3，4，8分別為拆分蛋白CCre的誘導，未誘導，純化；5，6，9為麥芽糖結合蛋白標簽MBP的誘導，未誘導，純化；10，11，12分別為完整的重組蛋白Cre的誘導，未誘導，純化);B:純化蛋白的體外活性檢測，以含有識別位點1xp的載體pLoxp_ccre629作為反應底物,Control:質粒對照；H+B:Hind III和EcoR I酶切；N:NCre酶切；C:CCre酶切；N+C:NCre和CCre酶切；Cre:Cre蛋白酶切；MBP:MBP蛋白酶切對照。圖3:轉基因毛狀根的⑶S組織染色。其中a為轉pCA-LoxP株系；b為轉pCA-NCre株系；c為轉pCA-nNCre株系；d為轉pCA-CCre 株系；e 為轉 pCA-nCCre 株系；f 為轉 pCAMBIA1305.1 株系；g 為轉 pCA-Cre 株系；h 為轉 pCA-nCre 株系；i 為轉 pCA_CCre_nNCre 株系；j 為轉 pCA-nCCre_nNCre 株系。圖4:刪除效率統(tǒng)計分析結果。圖5:轉基因毛狀根的PCR分子檢測。其中A:以轉基因株系 pCAMBIA1305.1、pCA-LoxP、pCA-Cre、pCA-nCre、pCA-CCre-nNCre、pCA-nCCre-nNCre煙草毛狀根基因組DNA為模板，用測序引物pCA_F和PCA-R進行刪除前后的PCR檢測；N:陰性(刪除前)；P:陽性(刪除后)；B:以轉pCA-NCre、pCA-nNCre、pCA-CCre、pCA-nCCre的不同株系的毛狀根基因組DNA為模板，用測序引物pCA-F和pCA-R進行PCR檢測。圖6:測序分析結果。具體實施例方式本專利技術所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產品。實施例1重組酶Cre的拆分根據Johannes Hirrlinger等人的研究,將完整的重組酶Cre從第59和60個氨基酸之間進行拆分，分別命名為NCre和CCre，同時在各個拆分片段之前融合核定位信號NLS(圖1)。實施例2拆分蛋白NCre、CCre以及完整重組蛋白Cre的體外誘導表達、純化和活性檢測原核表達載體構建設計擴增NCre 的上游引物:5’ -CGGAATTCATGTCCAATTTACTGACCGTAC-3，,下劃線為EcoRI 識別位點，下游引物:5’ -CCCAAGCTTCTAATTCAACTTGCACCATGCC-3’,下劃線為 HindIII識別位點；擴增CCre的上游引物:5 ’ -CGGAATTCATGAACCGGAAATGGTTTCCCG-3 ’，下劃線為EcoRI 識別位點，下游引物:5’-CCCAAGCTTCTAATCGCCATCTTCC本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種改造重組酶Cre的方法，其特征在于，其包括以下步驟：（1）將重組蛋白Cre在第59和60個氨基酸之間直接拆分為無活性的N端（NCre）和C端（CCre）兩部分，在各個拆分片段之前融合核定位信號NLS；（2）將拆分蛋白NCre和CCre構建到原核表達載體pMAL?C2X上，誘導表達純化之后，體外檢測拆分蛋白的活性；（3）將含有一對同向識別位點loxp的融合基因loxP?nos?loxP構建于pCAMBIA1305.1上得到中間載體pCA?LoxP，以此載體為骨架將拆分蛋白NCre和CCre構建上去，得到含有Cre/loxp系統(tǒng)的植物表達載體；（4）將構建的植物表達載體通過發(fā)根農桿菌介導的遺傳轉化轉化模式植物煙草，獲得轉基因毛狀根，通過GUS組織染色和PCR分子檢測改造的Cre/loxp系統(tǒng)的重組活性。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：高淵，羅克明，文夢玲，汪麗君，李超鋒，
申請(專利權)人：西南大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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