核酸的檢測制造技術

本發明專利技術涉及用于檢測和表征小核酸分子（例如，RNA（例如，小RNA例如微RNA（miRNA）和小干擾RNA（siRNA））和其他短核酸分子）的組合物和方法。更具體而言，本發明專利技術涉及用于檢測和定量RNA表達的方法。本發明專利技術進一步提供了miRNA和siRNA變體的檢測。

【技術實現步驟摘要】
核酸的檢測本申請是申請日為2007年6月1日、申請號為200780027007.0、專利技術名稱為“核酸的檢測”的專利技術專利申請的分案申請。
本專利技術涉及用于檢測和表征核酸分子（例如，RNA（例如，小RNA例如微RNA（miRNA）和小干擾RNA（siRNA））和其他短核酸分子）的組合物和方法。更具體而言，本專利技術涉及用于檢測和定量RNA表達的方法。本專利技術進一步提供了miRNA和siRNA的突變體（例如,缺失突變體）和變體的檢測。專利技術背景微RNA（miRNA）是新的一類非編碼RNA，其在無脊椎動物和脊椎動物基因組中編碼為短的反向重復（Ambros,(2001)Cell107,823-826;Moss(2002)Curr.Biol.12,R138-R140）。miRNA是靶mRNA翻譯和穩定性的調節劑，雖然大多數靶mRNA仍未鑒定。miRNA通過結合至在3'非翻譯區（UTRs）中的反義互補位點而以序列特異性的方式來控制靶mRNA的翻譯（Ambros,同上;Moss,同上;Lagos-Quintana等人,(2001)Science294,853-858;Lau等人,(2001)Science294,858-862;Lee等人,(2001)Science294,862-864）。miRNA還可以通過其他機制來抑制基因表達（參見，例如Pillai等人,Science309,1573-1576(2005);Humphreys等人,ProcNatlAcadSciUSA102,16961-16966(2005)）。在無脊椎動物和脊椎動物之間，幾種miRNA，例如let-7RNA、miR-1、miR-34、miR-60和miR-87是高度保守的，這暗示它們可以識別具有可能保守的功能的多個位點和/或多個靶（Lagos-Quintana等人,同上;Lau等人,同上;Lee等人,同上;Pasquinelli等人,(2000)Nature408:86）。小時序RNA（stRNA）lin-4和let-7代表了一亞類通過在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）中的遺傳分析而鑒定出的miRNA，它們在發育上受到調控并且它們本身控制發育進程，例如神經元重新布線（neuronalrewiring）的時機、持久幼蟲的形成、陰門的形成以及皮下細胞的終末分化。miRNA通常從60至70個核苷酸的折回RNA前體結構中切出，所述折回RNA前體結構有時在miRNA前體表達開始時（Grishok等人,(2001)Cell106,23-34;Hutvagner等人(2001)Science93,834-838;Ketting等人,(2001)GenesDev.15,2654-2659）或在非常豐富的miRNA的表達過程中被檢測出（Lagos-Quintana等人,同上;Lau等人,同上;Lee等人,同上）。一般地，發夾結構前體分子的僅一條鏈被切除并積累，這可能是由于其受到相關蛋白質的保護而免于RNA降解。這些假定的蛋白質可能介導了翻譯抑制。miRNA前體加工反應需要DicerRNaseIII和Argonaute家族成員（Grishok等人,同上;Hutvagner等人,同上;Ketting等人,同上）。除了它們對于基因表達的影響外，小RNA（例如，具有18-25個核苷酸的siRNA或miRNA）還可以用于治療和藥物發現領域（例如，藥品靶或藥劑）。因此，在某些情況下，重要的是大概知道在細胞中每種miRNA存在的量（例如，在治療前、在治療過程中或在治療后）。此外，miRNA基因的缺失和下調與癌癥（例如，B細胞慢性淋巴細胞白血病（CLL））相關，從而在本領域中產生了對于能夠檢測和表征miRNA表達的需要（參見，例如Calin等人,ProcNatlAcadSciUSA,99,15524-15529(2002)）。在某些情況下，也重要的是，比較miRNA在不同組織類型中的水平，或者比較在施加刺激（例如化學或物理干預）之前和之后miRNA的水平。由于相關的siRNA和miRNA可能在細胞中以少量存在，所以希望檢測方法是靈敏的和特異的。此外，對于某些應用而言，可能有利的是，鑒定出適用于高通量篩選的方法，例如均相（homogeneous）方法，多重（multiplexed）方法，或適用于高度平行的自動化操作和有限的溫度變化的方法。雖然miRNA在基因表達的調節中起著重要作用，但是缺少用于檢測和定量miRNA表達的有效技術。用于定量miRNA的方法基于凝膠電泳。通過Northern印跡法或者通過放射性的RNA酶抗性雙鏈體的存在來檢測miRNA。Northern印跡法和芯片雜交方法具有相對較低的分析靈敏度（Krichevsky等人2003），因此需要微克量的RNA來用于分析；此外，小RNA向過濾器的轉移可引起與定量的再現性有關的問題，并且通常不能修正成高通量。而且，基于RNA酶抗性的檢測方法需要高放射性的探針。此外，僅僅基于探針雜交的測定法可能不提供在序列方面密切相關的同種型之間的足夠的區分。備選的方法包括克隆miRNA，然后對插入片段進行測序。盡管該方法可適用于區分在密切相關的miRNA種類之間的單堿基差異，但是這種方法是耗時且費力的。與miRNA相似，小干擾RNA（siRNA）是通過稱為RNA干擾（RNAi）的應答而參與細胞防御（例如，針對病毒RNA）的小RNA分子（Cullen,B.R.,NatureImmunology,3:597-599(2002)）。通過作為針對細胞中存在雙鏈RNA的RNAi應答的一部分的Dicer酶和RNA誘導的沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）蛋白質復合體的作用，產生出一類siRNA（Khvorova,A.等人,Cell115:209-216(2003)）。另一類siRNA是合成的，并且包括通常21-23nt的短雙鏈體，其具有特征性的二核苷酸突出端（Elbashir,S.M.等人,EMBOJ.20:6877-6888(2001)），其通過所引入的載體的轉染或表達而被直接引入到細胞中（Paul,C.P.等人,NatureBiotechnology20:505-508(2002),美國專利申請公開號2003/0148519A1,通過提及而以其整體合并入本文以用于所有目的）。在某些情況下，siRNA似乎堅持作為確定的序列，這使得它們在功能和組成方面與miRNA相似（Elbashir,S.M.等人,同上）。需要用于檢測和表征（例如定量）miRNA和siRNA水平的有效且精確的方法。專利技術概述本專利技術涉及用于檢測和表征核酸分子（例如，RNA（例如，小RNA例如微RNA（miRNA）和小干擾RNA（siRNA））和其他短核酸分子）的組合物和方法。更具體而言，本專利技術涉及改進的用于檢測和表征（例如定量）RNA表達的方法。例如，本專利技術提供了一種方法，其包括：使至少一種核酸（例如，其包含不與干擾RNA互補的序列）與干擾RNA靶雜交從而產生檢測結構，并檢測該檢測結構。在一些實施方案中，干擾RNA靶為miRNA。在其他實施方案中，干擾RNA靶為siRNA。在一些實施方案中，siRNA是雙鏈本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于檢測miRNA靶的方法，其包括下列步驟：a)提供：i)miRNA靶；ii)第一種未標記的寡核苷酸，其包含與所述miRNA靶互補的第一區域以及與所述miRNA靶不互補的第二區域；iii)第二種未標記的寡核苷酸，其包含與所述miRNA靶的第二區域互補的第一區域以及與所述miRNA靶的所述第二區域不互補的第二區域；iv)逆轉錄酶；v)DNA聚合酶；以及vi)探針寡核苷酸，其中所述探針寡核苷酸的至少一部分與所述miRNA的至少一部分互補；b)在使得檢測結構能夠形成的條件下溫育組分(i)至(vi)；以及c)檢測所述檢測結構。

【技術特征摘要】
2006.06.01 US 60/810,0781.用于檢測miRNA靶的方法，其包括下列步驟：a)提供：i)miRNA靶；ii)第一種未標記的寡核苷酸，其由與所述miRNA靶的第一區域互補的3'部分以及與所述miRNA靶不互補的5'部分組成，其中所述第一區域包含所述miRNA靶的3'末端；iii)第二種未標記的寡核苷酸，其由與所述miRNA靶的第二區域同源的3'部分以及與所述miRNA靶的所述第二區域不同源的5'部分組成；iv)DNA聚合酶；v)探針寡核苷酸；vi)第一堆疊者寡核苷酸，其中所述第一堆疊者寡核苷酸的至少一部分與在所述第一種未標記的寡核苷酸的所述5'部分中的區域互補；以及vii)5'核酸酶；b)在使得能夠達到下述情形的條件下溫育組分(i)至(vii)：通過聚合酶鏈式反應來擴增所述miRNA靶從而形成miRNAcDNA，其中所述探針寡核苷酸的至少一部分與所述miRNAcDNA的至少一部分互補，并且其中在侵入性切割結構中所述探針寡核苷酸與所述miRNAcDNA雜交；c)用所述5'核酸酶切割在所述侵入性切割結構中的所述探針寡核苷酸；以及d)檢測在所述侵入性切割結構中的所述探針寡核苷酸的切割，其中在所述侵入性切割結構中的所述探針寡核苷酸的切割是所述miRNA靶存在的指示，其中所述方法不是診斷方法。2.權利要求1的方法，其中所述5'核酸酶不具有聚合酶活性。3.權利要求2的方法，其中所述5'核酸酶為古細菌物種的FEN-1核酸內切酶。4.權利要求1的方法，其中所述第一種未標記的寡核苷酸包含這樣的核酸序列，即使得在所述寡核苷酸和所述miRNA靶之間形成6-10個堿基對的雙鏈體。5.權利要求1的方法，其中所述探針寡核苷酸是未標記的。6.權利要求1的方法，其中所述提供DNA聚合酶包括提供逆轉錄酶。7.權利要求6的方法，其中在所述條件下，所述第一種未標記的寡核苷酸和所述逆轉錄酶用于反轉錄所述miRNA，從而產生miRNAcDNA靶。8.權利要求1的方法，其中所述第一堆疊者寡核苷酸包含5'部分，其中所述第一堆疊者寡核苷酸的所述5'部分與在所述第一種未標記的寡核苷酸的所述5'部分中的區域互補，該在所述第一種未標記的寡核苷酸的所述5'部分中的區域鄰近所述第一種未標記的寡核苷酸的與所述miRNA互補的所述3'部分。9.權利要求1的方法，該方法進一步包括提供viii)第二堆疊者寡核苷酸，其與在所述第二種未標記的寡核苷酸的所述5'部分中的區域互補。10.權利要求1的方法，其中所述檢測包括使用經標記的探針。11.權利要求10的方法，其中將所述經標記的探針構造成用于FRET檢測。12.第一種未標記的寡核苷...

【專利技術屬性】
技術研發人員：H·T·阿拉韋，V·萊米柴夫，
申請(專利權)人：第三次浪潮技術公司，
類型：發明
國別省市：