本文提供了利用納米孔光學檢測和分析聚合物諸如多核苷酸的多種方法、系統和裝置，例如用于確定核酸的序列。在某些變化形式中，提供了用于確定多核苷酸的核苷酸序列的方法和系統，所述方法和系統包括當多核苷酸移位穿過納米孔時測量混合的FRET信號以及從混合的FRET信號確定多核苷酸的核苷酸序列。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利說明】基于納米孔的通過混合的FRET檢測的核酸分析 相關申請的交叉引用 本申請要求2013年5月24日遞交的美國臨時專利申請號61/827, 519的優先權 的權益，其內容以其整體被并入本文。 背景 在過去十年間開發的DNA測序技術已經徹底改革了生物科學，例如Lerner等 人，TheAuk, 127:4-15(2010) ;Metzker，NatureReviewGenetics, 11:31-46(2010);Holt 等人，GenomeResearch, 18:839-846(2008);并且具有徹底改革醫療實踐的許多方面的 可能性，例如，Voelkerding等人，ClinicalChemistry, 55:641-658 (2009);Anderson等 人，Genes, 1:38-69 (2010);Freeman等人，GenomeResearch，19:1817-1824(2009);Tucker 等人，Am.J.HumanGenet.，85:142-154(2009)。然而，要實現這種可能性，仍然存在許多 必須解決的挑戰，包括減少每次運行測序的成本、簡化樣品制備、減少運行時間、增加讀段 (read)長度、改善數據分析等等，例如，Baker,NatureMethods, 7:495-498 (2010);Kircher 等人，Bioessays, 32:524-536 (2010);Turner等人，AnnualReviewofGenomicsand HumanGenetics, 10:263-284(2009)。利用納米孔的單分子測序可以解決這些挑戰中的一 些，例如，Maitra等人，Electrophoresis, 33:3418-3428 (2012);Venkatesan等人，Nature Nanotechnology, 6:615-624 (2011);然而，這種方法具有其自身的一套技術困難，諸如，可 靠的納米孔制造、DNA移位率的控制、核苷酸區分、對來自納米孔傳感器的大型陣列的電信 號的檢測等等，例如，Branton等人，NatureBiotechnology, 26 (10) : 1146-1153 (2008); Venkatesan等人（以上引用）。 核苷酸的光學檢測已經作為納米孔測序領域中的一些技術困難的潛在的解決方 案被提出，例如Huber,國際專利公布W0 2011/040996 ;Russell,美國專利6, 528, 258; Pittaro,美國專利公布2005/0095599Joyce，美國專利公布2006/0019259 ;Chan，美國專 利 6, 355, 420;McNally等人，NanoLett.，10 (6) : 2237-2244 (2010)等等。然而，由于多種 原因，并未實現基于光學的納米孔測序，所述多種原因包括缺乏合適的制造技術以及缺乏 對此類系統的元件如何相互作用的認識。 鑒于上述內容，如果存在允許對分析物諸如核酸的序列的成功的光學感測和分析 的光學元件的可用的材料和配置，這對于通常的納米孔傳感器技術和其特定應用，諸如基 于光學的納米孔測序將是有利的。 概述 本文提供了在微流控和/或納米流控裝置中光學檢測和分析諸如多核苷酸的聚 合物用于確定核酸的序列的多種方法，所述微流控和/或納米流控裝置諸如使用納米孔的 那些。 在某些變化形式中，一種確定多核苷酸的核苷酸序列的方法包括以下步驟：(a) 使多核苷酸，例如單鏈多核苷酸或雙鏈多核苷酸移位穿過納米孔，以便多核苷酸的核苷酸 順序經過與納米孔毗鄰放置的FRET對的第一成員，當核苷酸離開納米孔時多個核苷酸處 于FRET對的第一成員的FRET距離內并且核苷酸的至少一部分被FRET對的第二成員標記； (b)使與納米孔毗鄰的FRET對暴露于光束以便FRET在FRET距離內的FRET對的第一成員 與多個第二成員之間發生以產生混合的FRET信號；(c)當多核苷酸移位穿過納米孔時測量 混合的FRET信號；以及（d)從混合的FRET信號確定多核苷酸的核苷酸序列。在一些實施 方案中，納米孔被布置在固相膜中并且FRET對的第一成員附接至固相膜，與所述納米孔毗 鄰。在其他實施方案中，納米孔是蛋白質納米孔并且FRET對的第一成員附接至蛋白質納米 孔。 在另一變化形式中，一種確定多核苷酸的核苷酸序列的方法包括以下步驟：(a) 使多核苷酸，例如單鏈多核苷酸或雙鏈多核苷酸移位穿過具有出口的納米孔，以便多核苷 酸的核苷酸在離開納米孔后順序通過FRET區域，FRET區域在此通過期間包含多個核苷酸 并且核苷酸的至少一部分被FRET對的至少一個第二成員標記并且FRET對的至少一個第一 成員處于FRET區域內；(b)使FRET區域內的FRET對的第一成員和第二成員暴露于光束以 便FRET在FRET對的第一成員和第二成員之間發生以產生混合的FRET信號；（c)當多核苷 酸移動穿過FRET區域時測量混合的FRET信號；以及（d)從混合的FRET信號確定多核苷酸 的核苷酸序列。 在另一變化形式中，一種確定多核苷酸的核苷酸序列的方法包括以下步驟：(a) 使具有標記的核苷酸的多核苷酸，例如單鏈多核苷酸或雙鏈多核苷酸移位穿過納米孔，所 述納米孔被定制尺寸（dimension)以便核苷酸上的標記物被限制以抑制FRET反應，核苷酸 上的標記物作為FRET對的第二成員，并且以便多核苷酸的核苷酸在離開納米孔后順序通 過FRET區域，FRET區域在此通過期間包含多個核苷酸并且FRET對的至少一個第一成員處 于FRET區域內；(b)使FRET區域內的FRET對的第一成員和第二成員暴露于光束以便FRET 在第一成員和第二成員之間發生以產生混合的FRET信號；（c)當多核苷酸移動穿過FRET 區域時測量混合的FRET信號；以及（d)從混合的FRET信號確定多核苷酸的核苷酸序列。 在許多實施方式和應用中例證了多種方法、系統和裝置，其中的一些被總結如下 并且貫穿本說明書。 附圖簡述 圖1A示意性地闡明了具有對用單一種類的受體分子標記的多核苷酸分析物進行 的混合的FRET信號采集的一個實施方案。 圖1B顯示了用單一種類的受體分子標記的測試多核苷酸的混合的FRET信號的數 據。 圖1C示意性地闡明了具有對用兩種受體分子標記的多核苷酸分析物進行的混合 的FRET信號采集的另一個實施方案。 圖1D顯示了用兩種受體分子標記的測試多核苷酸的混合的FRET信號的數據。 圖2A至2C闡明了雜合生物傳感器的一個實施方案。 圖2D闡明了通過使用寡核苷酸雜交來放置FRET對的成員的裝置的實施方案。 圖2E闡明了雜合納米孔的一個實施方案，其中固態膜（201)的表面涂覆了疏水性 層（202)，脂質層（203)粘附于疏水性層（202)上。脂質與插入的孔蛋白質形成千兆歐姆封 接（gigaohmseal)〇 詳述 雖然本文描述的多種方法、系統和裝置服從于多種修改形式和替代形式，其細節 已經通過舉例顯示于附圖中并且將被詳細描述。然而應該理解的是，意圖并非限制于所描 述的具體的實施方案。相反，意圖覆蓋落在本專利技術的精神和范圍內的所有修改形式、等價物 和替代物。例如，為了闡明的目的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種確定多核苷酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括以下步驟：使多核苷酸移位穿過納米孔以便所述多核苷酸的核苷酸順序經過與所述納米孔毗鄰放置的FRET對的第一成員，當所述核苷酸離開所述納米孔時多個所述核苷酸處于所述FRET對的所述第一成員的FRET距離內并且所述核苷酸的至少一部分被所述FRET對的第二成員標記；使與所述納米孔毗鄰的所述FRET對暴露于光束以便FRET在所述FRET距離內的所述FRET對的所述第一成員與多個第二成員之間發生以產生混合的FRET信號；當所述多核苷酸移位穿過所述納米孔時測量混合的FRET信號；以及從所述混合的FRET信號確定所述多核苷酸的核苷酸序列。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬丁·胡伯，巴森·E·克蘭西，保羅·哈登伯爾，
申請(專利權)人：昆塔波爾公司，
類型：發明
國別省市：美國;US
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