本申請描述了用于改善無細胞合成系統(tǒng)中正確折疊的生物學活性目標蛋白的表達的方法和系統(tǒng)。所述方法和系統(tǒng)使用具有活性氧化磷酸化系統(tǒng)的細菌無細胞提取物，并且包含外源蛋白伴侶。可通過用來制備所述無細胞提取物的細菌表達所述外源蛋白伴侶。所述外源蛋白伴侶可為蛋白二硫鍵異構酶和/或肽基脯氨酰順反異構酶。發(fā)明專利技術人發(fā)現(xiàn)，蛋白二硫鍵異構酶和肽基脯氨酰順反異構酶的組合對正確折疊的生物學活性目標蛋白的量產(chǎn)生協(xié)同增加。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利說明】使用呈現(xiàn)出蛋白伴侶表達水平升高的經(jīng)轉化的細菌細胞在 細菌無細胞合成系統(tǒng)中表達生物學活性蛋白 相關申請的交叉引用 本申請要求于2013年4月19日提交的美國專利申請第61/813,914號和于2014 年2月7日提交的美國專利申請第61/937,069號的優(yōu)選權的益處，其各自的公開通過引用 整體并入本文。 涉及"序列表"、表或計算機程序的列表附錄提交為ASCII文本文件 為了所有目的，將于2014年4月16日創(chuàng)建的文件-58-2PC.TXT中書寫的序列表 (73, 728字節(jié)，機讀格式IBM-PC，MS-Windows操作系統(tǒng)）通過引用整體并入本文。 專利技術背景 在細菌無細胞合成系統(tǒng)中表達蛋白是一種用于表達重組靶蛋白的成熟建立的技 術。可從表達或過表達目標蛋白的細菌制備提取物以提供細菌無細胞合成系統(tǒng)，所述細菌 無細胞合成系統(tǒng)具有取決于所述蛋白的改變的特性。然而，細菌生長期間蛋白的過表達經(jīng) 常導致細菌較慢的生長速率和從所述細菌制備的提取物中較低的蛋白合成活性。 進一步，來自這樣的提取物的重組蛋白的表達通常導致不正確的折疊和生物學活 性的損失。蛋白伴侶的使用可改善蛋白的正確折疊和其生物學活性。因此，存在對改善的 用于表達重組蛋白的細菌細胞提取物的需求，所述細菌細胞提取物從過表達蛋白伴侶的細 菌制備，其中這樣的提取物可合成大量正確折疊的蛋白。如下所述，本專利技術滿足以上這些需 求和其他需求。 專利技術概述 本公開提供用于改善無細胞合成系統(tǒng)中生物學活性和/或正確折疊的目標蛋白 的表達的方法和系統(tǒng)。所述無細胞合成系統(tǒng)包含細菌提取物，所述細菌提取物具有活性氧 化磷酸化系統(tǒng)和用于無細胞蛋白合成所需的組分。所述無細胞合成系統(tǒng)還包含外源蛋白伴 侶。在某些實施方案中，通過用來制備所述細菌提取物的細菌表達外源蛋白伴侶。 因此，在一個方面，描述了改善細菌無細胞合成系統(tǒng)中生物學活性蛋白的表達水 平的方法，所述方法包括以下步驟： i)制備細菌提取物，所述細菌提取物具有活性氧化磷酸化系統(tǒng)且包含用于無細胞 蛋白合成所需的生物學功能tRNA、氨基酸和核糖體，其中用來制備所述提取物的細菌以至 少約lgm/升的提取物濃度表達外源蛋白伴侶； ii)合并所述細菌提取物與編碼目標蛋白的核酸，以產(chǎn)生細菌無細胞合成系統(tǒng)； 以及iii)在允許目標蛋白的表達至濃度至少約100mg/L的條件下，孵育所述細菌無細 胞合成系統(tǒng)。 在第二方面，描述了用于表達生物學活性蛋白的細菌無細胞合成系統(tǒng)，所述系統(tǒng) 包含：i)細菌的無細胞提取物，所述細菌的無細胞提取物具有活性氧化磷酸化系統(tǒng)且含 有用于無細胞蛋白合成所需的生物學功能tRNA、氨基酸和核糖體，并且其中在細菌中以至 少lgm/升的提取物水平表達外源蛋白伴侶；和， ii)編碼目標蛋白的核酸， 其中所述細菌無細胞合成系統(tǒng)表達目標蛋白至濃度至少約100mg/L。 在第三方面，描述了在細菌無細胞合成系統(tǒng)中表達正確折疊的生物學活性蛋白的 方法，所述方法包括以下步驟： i)制備細菌提取物，所述細菌提取物包含用于無細胞蛋白合成所需的生物學功能 tRNA、氨基酸、核糖體，蛋白二硫鍵異構酶和肽基脯氨酰基順/反異構酶，其中蛋白二硫鍵 異構酶和肽基脯氨酰基順/反異構酶以足以改善正確折疊的生物學活性蛋白的表達的濃 度存在； ii)合并所述細菌提取物與編碼目標蛋白的核酸；以及 iii)在允許目標蛋白的表達和正確折疊的條件下，孵育所述細菌提取物與所述核 酸。 在第四方面，描述了用于表達生物學活性蛋白的細菌無細胞合成系統(tǒng)，所述系統(tǒng) 包含： i)細菌的無細胞提取物，所述細菌的無細胞提取物具有活性氧化磷酸化系統(tǒng)且含 有用于無細胞蛋白合成所需的生物學功能tRNA、氨基酸和核糖體，并且還包含蛋白二硫鍵 異構酶和肽基脯氨酰基順/反異構酶， 其中，所述蛋白二硫鍵異構酶和肽基脯氨酰基順/反異構酶以足以改善正確折疊 的生物學活性蛋白的表達的濃度存在；和 ii)編碼目標蛋白的核酸， 其中，所述細菌無細胞合成系統(tǒng)表達目標蛋白至濃度至少約100mg/L。 在第五方面，描述了改善大腸桿菌（Ecoli)細胞培養(yǎng)物的活力和/或生長速率的 方法，所述方法包括以下步驟： i)用表達蛋白DsbC的核酸轉化大腸桿菌，所述表達蛋白DsbC的核酸可操作地連 接組成型啟動子；以及 ii)在允許過表達DsbC蛋白至胞內濃度至少lmg/ml的條件下，培養(yǎng)被轉化的大腸 桿菌細胞。 附圖簡述 圖1顯示真核PDI和細菌DsbC為功能上可互換的。 圖2A顯示實施例中所描述的蛋白伴侶順序表達篩選的示意圖。 圖2B顯示通過將細菌無細胞系統(tǒng)表達的蛋白伴侶加入至細菌無細胞合成系統(tǒng)可 改善IgG滴度。 圖3顯示蛋白伴侶Skp、SlyD和FkpA改善正確組裝的IgG的溶解性和/或量。 圖4顯示蛋白伴侶FkpA改善IgG蛋白的溶解性和折疊。 圖5顯示將純化的FkpA加入至含有DsbC的提取物促進IgG的折疊。 圖6顯示將外源的DsbC蛋白加入至含有FkpA的提取物增加IgG滴度。 圖7顯示在提取物中通過CFPS所產(chǎn)生的GMCSF蛋白的量，所述提取物來自表達蛋 白伴侶DsbC或FkpA的所示的菌株。 圖8顯示轉化有質粒的細菌菌株的生長速率，所述轉化有質粒的菌株在組成型啟 動子的控制下表達IX或2X拷貝的DsbC(上圖）。下圖顯示存在于周質裂解物中的DsbC蛋 白的量。 圖9顯示通過過表達IX或2X拷貝DsbC的細菌菌株所產(chǎn)生的DsbC蛋白的量。上 圖顯示細胞內濃度。下圖顯示提取物濃度。圖10顯示轉化有質粒的細菌菌株的生長速率（上圖），所述轉化有質粒的菌株在 組成型啟動子的控制下表達IX或2X拷貝FkpA。下面左圖顯示存在于總提取物中的FkpA 蛋白的量，所述提取物制備自表達IX和2X拷貝FkpA的細菌。下面右圖顯示細菌菌株的倍 增時間。 圖11顯示來自表達IX和2X拷貝FkpA的細菌的提取物中FkpA濃度的測定量。 圖12顯示將C端His標簽加至FkpA的結果。（a)顯示通過在30 °C下提取物 活化（預孵育）后的離心旋轉，增加了提取物的FkpA水平，所述提取物制備自過表達 FkpA-His(2XFkpA-His(e49))的細菌。（b)顯示含有FkpA-His的提取物比含有野生型FkpA 的提取物產(chǎn)生更多的總IgG(比較2XFkpA(e44)與2XFkpA-His(e49))，并且通過將活化后的 提取物離心增加了正確折疊的IgG(比較最終旋轉的2XFkpA與最終旋轉的2XFkpA-His)。 對照（Con) 1和對照2為對照提取物，其制備自不表達FkpA的細菌。 圖13顯示蛋白伴侶的過表達改善了開放式無細胞合成系統(tǒng)中幾種IgG的產(chǎn) 量。㈧在SBJY001、2xDsbC和2xD+2xF提取物中，在14C-亮氨酸存在下表達曲妥珠單 抗（trastuzumab)、結合CD30抗原的布妥昔單抗（brentuximab)以及與生殖細胞系輕鏈 Vk3-20結合的生殖細胞系重鏈VH3-7和VH3-23,并且通過SDS-PAGE和放射自顯影顯現(xiàn)。 (B)如實施例所述定量不同的提取物中所表達的組裝的IgG。 定義 除非另有定義，本文使用的技術和科學術語與本領域普通技術人員通常理解的含 義相同。參見例如，Lack本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
改善細菌無細胞合成系統(tǒng)中生物學活性蛋白的表達水平的方法，其包括以下步驟：i)制備細菌提取物，所述細菌提取物具有活性氧化磷酸化系統(tǒng)且包含用于無細胞蛋白合成所需的生物學功能tRNA、氨基酸和核糖體，其中用來制備所述提取物的細菌以至少約1gm/升的提取物濃度表達外源蛋白伴侶；ii)合并所述細菌提取物與編碼目標蛋白的核酸，以產(chǎn)生細菌無細胞合成系統(tǒng)；以及，iii)在允許所述目標蛋白表達至濃度至少約100mg/L的條件下，孵育所述細菌無細胞合成系統(tǒng)。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：艾麗絲·揚，丹·格羅夫，帕特里克·里弗斯，克里斯托弗·D·薩諾斯，
申請(專利權)人：蘇特羅生物制藥公司，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US
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