本發明專利技術公開了一種多標簽抗原，該多標簽抗原包括9種標簽，分別為GST標簽、HA標簽、T7標簽、V5標簽、Myc標簽、StrepII標簽、Flag標簽、EGFP標簽和His標簽，這9種標簽按照GST-HA-T7-V5-Myc-StrepII-Flag-EGFP-His的順序依次串聯。本發明專利技術還公開了該多標簽抗原的制備方法及其在免疫印跡中的應用。本發明專利技術中公開的多標簽抗原，可以滿足大多數免疫印跡反應設置陽性對照的需求，具有良好的兼容性和很強的免疫印跡反應特異性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術設及免疫印跡領域，尤其設及。
技術介紹
免疫印跡技術是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測的技術。對已知表 達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢 ，具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優點，是檢測蛋白質特性、表達與分布的一種 最常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測、多膚分子的質量測定及病毒的抗體或抗原檢 測等，因此免疫印跡技術在分子生物學研究中具有廣泛的應用。 在設計表達一種蛋白時，通常都會進行融合蛋白表達，即在蛋白質序列的N端或 者C端加入常用的標簽序列，如6地is、Flag、Myc等。在做免疫印跡檢測目的蛋白表達量時 通常只需檢測目的蛋白上加入的標簽序列即可，即用6*化S、Flag、Myc等標簽單抗與目的 蛋白抗原進行免疫印跡反應，檢測出的信號強弱即反應出目的蛋白表達量的高低。在運用 質粒轉染真核細胞表達目的蛋白，或者利用病毒侵染來表達某種目的蛋白時，往往會遇到 蛋白表達量很微量或者不表達的情況，此時采用免疫印跡技術檢測目的蛋白的表達情況很 可能不會出現明顯的信號。在運種情況下，需要判斷到底是目的蛋白真實的表達量很微量， 還是免疫印跡檢測的反應體系出現問題導致沒有出現信號。因此在做免疫印跡檢測時通常 都需要設置陰性對照和陽性對照，在出現上述情況時，若陽性對照工作正常出現明顯的反 應信號，則說明待研究的目的蛋白表達量確定是微量表達或者不表達。 常用的標簽有GST標簽、HA標簽、Str巧II標簽、Flag標簽、EGFP標簽和His標簽 等多種，在蛋白檢測中，不同的目標蛋白根據其性質往往會選擇不同的標簽序列，現有技術 中多W單個標簽作為陽性對照，運樣當待測的多種蛋白質含有多個不同的標簽序列時，貝U 需要多個相對應的陽性對照，即費時費力，也增加了檢測成本。
技術實現思路
為了克服現有技術的缺陷，本專利技術公開了一種多標簽抗原，W滿足大多數免疫印 跡反應設置陽性對照的需求。其技術方案如下： 本專利技術提供了一種多標簽抗原，包括9種標簽，分別為GST標簽、HA標簽、T7標簽、 V5標簽、Myc標簽、Str巧II標簽、Flag標簽、EGFP標簽和His標簽。 優選地，該9種標簽按照GST-HA-T7-V5-Myc-Str巧II-Flag-EGFP-His的順序依次 串聯。[000引優選地，9種標簽的序列為SEQIDN0. 1所示的核巧酸序列。 本專利技術還提供了該多標簽抗原的制備方法，包括W下步驟：(a)、人工合成SEQIDN0:1序列，并在SEQIDN0:1序列的5'端和3'端分別設置限 審IJ性內切酶位點，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達載體，測序，得到包含該沈QIDN0. 1序 列的質粒； 化）、將步驟（a)中得到的質粒轉化入表達菌株，進行蛋白表達，并使用儀柱純化 該蛋白。 優選地，步驟（a)中，設置在5'端的限制性內切酶位點為化OI，設置在3'端的限 制性內切酶位點為化OI。 優選地，步驟（a)中，蛋白表達載體為祀T28a。 優選地，步驟化）中，表達菌株為大腸桿菌表達菌株Rosseta值E3)。 優選地，該多標簽抗原的制備方法包括W下步驟：(a)、人工合成SEQIDN0:1序列，并在SEQIDN0:1序列的5'端和3'端分別設置限 制性內切酶位點化OI和化OI，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達載體祀T28a，測序，得 到包含該SEQIDN0:1序列的質粒祀T28a-MultiTag-G9;化）、將步驟（a)中得到的質粒祀T28a-MultiTag-G9轉化入大腸桿菌表達菌株 Rosseta(DE3)，進行蛋白表達，并使用儀柱純化該蛋白。[001引本專利技術還提供了一種多標簽抗原的重組載體，即根據上述步驟（a)得到的pET28a-MultiTag-G90 本專利技術還提供了上述多標簽抗原在免疫印跡中的應用。 本專利技術公開的多標簽抗原，能夠滿足大多數免疫印跡反應設置陽性對照的需求。 其具有良好的兼容性和很強的免疫印跡反應特異性，并大大節省了檢測成本。 W下將結合附圖對本專利技術作進一步說明。【附圖說明】 圖1示出了本專利技術一個較佳實施例中制備的多標簽抗原的免疫印記（Western blot)實驗結果。【具體實施方式】W下通過具體的實施例對本專利技術的技術方案做進一步的描述。W下的實施例是對 本專利技術的進一步說明，而不是限制本專利技術的范圍。 1、MultiTag-Gg人工基因合成MultiTag-Gg包含 9 種常用檢測標簽，分別是GST、HA、T7、V5、Myc、StrepII、Flag、EGFP和His標簽。具體的DNA序列分別是：GST標簽 His標簽catcatcatcatcatcat 18 將上述9種標簽DNA序列依次串聯在一起通過人工基因合成的方法構建出 MultiTag-Gg完整序列，并在此DNA序列5'端加上化OI限制性內切酶位點CCATGG，3'端 加上化OI限制性內切酶位點CTCGAG，通過化OI和化OI雙酶切、割膠回收、T4連接酶連 接克隆至蛋白表達載體祀T28a。MultiTag-Gg完整編碼區為1566bp，共含有522個氨基酸， 表達蛋白的理論分子量為5991抓a. 2、MultiTag-G9蛋白的表達與純化 將測序正確的祀T28a-MultiTag-G9質粒轉化入大腸桿菌表達菌株 Rosseta值E3)，挑取單菌落接種至50mlLB液體培養基，加入卡那霉素終濃度50ug/ml和氯 霉素34ug/ml雙抗性篩選，37 °C，200巧m培養過夜。第二天按照2 :100比例轉接至250ml LB液體培養基，加入卡那霉素終濃度50ug/ml和氯霉素34ug/ml雙抗性篩選，共轉接4瓶， 37°C，200rpm培養至菌液0D600檢測數值為0. 8時加入誘導劑異丙基-0 -D硫代半乳糖巧 使其終濃度為0. 1-0. 5mM，誘導培養4h后，4°C700化pm離屯、收集菌體。將此菌體按照每克 加入40ml的比例懸浮于20mMTris.Cl,P冊.0,300mM化Cl,10%Glycerol裂解緩沖液，超 聲前加入終濃度ImM苯甲基橫酷氣，超聲波破碎儀進行菌體破碎。超聲裂解條件為超聲3 秒間隔5秒，30%超聲功率，超聲15min。當菌液變得清亮時離屯、收集上清液，取樣進行聚丙 締酷胺凝膠電泳檢測，并采用儀柱純化MultiTag-Gg蛋白，具體純化操作步驟參照NiNTA Beads6FF說明書進行，獲得純度約95%的MultiTag-Gg蛋白（得到的MultiTag-Gg蛋白 濃度為 350ug/ml)。[004引3、MultiTag-Gg的免疫印跡應用 純化好的MultiTag-Gg進行聚丙締酷胺凝膠電泳，按照每泳道上樣5ng MultiTag-G9蛋白進行聚丙締酷胺凝膠電泳，轉膜，封閉，一抗結合，二抗結合，曝光顯色進 行Westernblot免疫印跡反應。9種相對應的商品化標簽單抗均能與MultiTag-Gg蛋白進 行靈敏而特異性的免疫印跡反應，結果如附圖1所示。 本專利技術獲得的多標簽抗原蛋白可作為免疫印跡反應的陽性對照，具有良好的兼容 性和很強的免疫印跡反應特異性。一種多標簽抗原蛋白即可滿足大多數常用標簽免疫印跡 反應的陽性對照之需，兼容性強；本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種多標簽抗原，其特征在于，所述多標簽抗原包括9種標簽，分別為GST標簽、HA標簽、T7標簽、V5標簽、Myc標簽、StrepII標簽、Flag標簽、EGFP標簽和His標簽。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：曹平生，
申請(專利權)人：翌圣生物科技上海有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31
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