游離人絨毛膜性腺激素β亞單位測試試劑盒及其測試方法技術

本發明專利技術公開了一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位(F-β-hCG)測試試劑盒，該試劑盒由磁分離試劑，試劑R1，試劑R2，標準品，質控品，校準品，清洗濃縮液及發光底物組成，本發明專利技術還公開了該試劑盒的制備方法。本發明專利技術試劑盒將化學發光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體系，與現有酶聯免疫的技術相比，本發明專利技術具有更高的特異性，靈敏度，獲得檢測結果的時間短，操作方式簡便，檢測結果準確可靠，大大降低了產品成本。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及測定血清的試劑盒及其測試方法，尤其是涉及測定血清中游離人絨毛膜性腺激素β亞單位含量的試劑盒及其測試方法。
技術介紹
人絨毛膜促性腺激素(hCG)是一種胎盤滋養層細胞分泌的糖蛋白激素，由α亞基和β亞基組合而成。兩種亞基均可以游離態出現在血液中。hCGα亞基與垂體糖蛋白激素的α亞基相同，用免疫學方法無法將它們區別開，而hCG的β亞基是hCG的特有結構，也決定了其分子的生物學和免疫學特性，分子量為22.2KD。在整個懷孕過程中，游離F-β-hCG通常是隨完整的hCG一起出現和增長，所以游離β-hCG是診斷早孕的一項重要的檢測指標，其分泌與滋養細胞的數量密切相關。血清F-β-hCG測定還能診斷異位妊娠、先兆流產、葡萄胎及滋養細胞腫瘤，而且也是治療后的及預后觀察的重要檢測指標，對其他疾病如卵巢生殖細胞腫瘤、男性肇丸腫瘤，非滋養細胞疾病、非生殖細胞也有輔助診斷意義。從檢測角度上來說，目前臨床上用于測定F-B-hCG的方法主要有放免法、ELISA法、化學發光法等。過去以放免為代表的人絨毛膜促性腺激素β亞單位(F-β-hCG)測定試劑盒受方法學的限制，其靈敏度和抗干擾能力嚴重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場；酶聯免疫法(ELISA)作為定性檢測的方法，抗原、抗體的結合反應是在固相(ELISA板反應孔)表面進行的，其靈敏度、特異性均較好，且經濟實惠，所以是應用得最廣、最多的方法。化學發光法其靈敏度高，從化學角度和自動化程度看，化學發光法優于酶聯免疫法。這些方法雖然都有很多優點，但在檢測的靈敏度、特異性、穩定性、檢測用時等方面還有待進一步提高。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術所要解決的技術問題是克服上述現有技術的不足，提供一種特異性強，靈敏度高，獲得檢測結果的時間短，操作方式簡便，檢測結果穩定可靠的的游離人絨毛膜性腺激素β亞單位(F-β-hCG)的測試試劑盒及其測試方法。為達到上述目的，本專利技術提供如下技術方案：一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位(F-β-hCG)測試試劑盒，該試劑盒由磁分離試劑，試劑R1，試劑R2，標準品，質控品，校準品，清洗濃縮液及發光底物組成，其中：磁分離試劑：標記有小鼠抗人F-β-hCG的單克隆抗體的納米磁性微球，所述標記有小鼠抗人F-β-hCG的單克隆抗體的納米磁性微球濃度為100μg/ml；試劑R1：含有堿性磷酸酶標記的F-β-hCG抗體，所述堿性磷酸酶標記的F-β-hCG抗體的濃度為0.2μg/ml；試劑R2：含有牛γ球蛋白質組分的緩沖液；標準品，質控品和校準品：含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液，所述標準品的濃度為0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml，所述質控品濃度為10,80mIU/ml，所述校準品濃度為15,80μIU/ml；清洗濃縮液：含有Tween-20和Proclin-300的緩沖液；發光底物：金剛烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金剛烷的衍生物IUMIPHOS530的濃度為10μg/ml。一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位(F-β-hCG)測試試劑盒，由下述體積分數組成：磁分離試劑5％-7％，試劑R15％-7％，試劑R25％-7％，標準品5％-7％，質控品1％-3％，校準品3％-6％，清洗濃縮液20％-40％，發光底物30％-50％。優選地，一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位測試試劑盒，由下述體積分數組成：磁分離試劑5％，試劑R15％，試劑R25％，校準品5％，質控品1％，校準品3％，清洗濃縮液26％，發光底物50％。優選地，一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位測試試劑盒，由下述體積分數組成：磁分離試劑6％，試劑R16％，試劑R26％，校準品6％，質控品2％，校準品4％，清洗濃縮液30％，發光底物40％。優選地，一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位測試試劑盒，由下述體積分數組成：磁分離試劑7％，試劑R17％，試劑R27％，校準品7％，質控品3％，校準品6％，清洗濃縮液33％，發光底物30％。所述試劑盒中各組分按照如下制備方法制得：第一步：磁分離試劑的制備過程一、磁珠緩沖液配制操作規程：(1)稱取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，稱取0.96gTween-20于20ml容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；(2)用移液器將Proclin-300量取0.2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；(3)調節PH計測量其PH值；用4MHCl或4MNaOH調PH，測量其PH在7.95－8.05之間即符合要求；(4)稱取BSAV(牛血清白蛋白(第五組分))3g倒入上述1L容器中；(5)最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7.95－8.05之間即符合要求，用0.2um濾器過濾即得；過濾完后貼好標簽于2-8℃冷庫貯存；二、磁分離試劑的配制：(1)將1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亞胺)溶于50ulDMSO中，即濃度為20mg/mL；取2mgF-β-hCG抗體溶于PH9.5的0.1mol/LPB緩沖液中至總體積為1ml；(2)計算DSS的投入量，按照以下公式計算：(抗體質量/16000)×10×368/CDSS)，其中CDSS指代DSS的物質的量濃度mol/L；(3)用移液槍吸取相應體積的DSS加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min；(4)將步驟3抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中,然后放入到sigma2-16k高速冷凍離心機中在3000g的離心力下濃縮約30min至體積為0.5ml；(5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直徑在0.9-1.5μm之間，加入5ml反應杯中，放入專用試管架，經磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB，混勻30秒，上架，去上清，重復操作3次；將步驟4獲得的抗體溶液加入到磁珠中，混勻后室溫反應4小時，保持混勻狀態；(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分鐘，其中Tris的加樣量為1mg抗體加0.15mlTris；(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已經標記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清，重復操作3次；(9)用100ml磁珠保存液將磁珠轉入125ml玻璃瓶，即為0.05％的F-β-hCG磁分離試劑；(10)將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1：2.3的比例混勻，即得本專利技術試劑盒中磁分離試劑；第二步：試劑R1的制備過程一、試劑R1稀釋液配制操作規程：(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl20.05g于燒瓶中；然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；(2)用4MHCl或4MNaOH調PH，測量本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位測試試劑盒，該試劑盒由磁分離試劑，試劑R1，試劑R2，標準品，質控品，校準品，清洗濃縮液及發光底物組成，其中：磁分離試劑：標記有小鼠抗人F?β?hCG的單克隆抗體的納米磁性微球，所述標記有小鼠抗人F?β?hCG的單克隆抗體的納米磁性微球濃度為100μg/ml；試劑R1：含有堿性磷酸酶標記的F?β?hCG抗體，所述堿性磷酸酶標記的F?β?hCG抗體的濃度為0.2μg/ml；試劑R2：含有牛γ球蛋白質組分的緩沖液；標準品，質控品和校準品：含有一定量F?β?hCG抗原的小牛血清溶液，所述標準品的濃度為0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml，所述質控品濃度為10,80mIU/ml，所述校準品濃度為15,80mIU/ml；清洗濃縮液：含有Tween?20和Proclin?300的緩沖液；發光底物：金剛烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金剛烷的衍生物IUMIPHOS530的濃度為10μg/ml。

【技術特征摘要】
1.一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位測試試劑盒，該試劑盒由磁分離試劑，試劑R1，試
劑R2，標準品，質控品，校準品，清洗濃縮液及發光底物組成，其中：磁分離試劑：標
記有小鼠抗人F-β-hCG的單克隆抗體的納米磁性微球，所述標記有小鼠抗人F-β-hCG
的單克隆抗體的納米磁性微球濃度為100μg/ml；試劑R1：含有堿性磷酸酶標記的
F-β-hCG抗體，所述堿性磷酸酶標記的F-β-hCG抗體的濃度為0.2μg/ml；試劑R2：含
有牛γ球蛋白質組分的緩沖液；標準品，質控品和校準品：含有一定量F-β-hCG抗原的
小牛血清溶液，所述標準品的濃度為0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200
(S5)mIU/ml，所述質控品濃度為10,80mIU/ml，所述校準品濃度為15,80mIU/ml；清
洗濃縮液：含有Tween-20和Proclin-300的緩沖液；發光底物：金剛烷的衍生物
IUMIPHOS530，所述金剛烷的衍生物IUMIPHOS530的濃度為10μg/ml。
2.根據權利要求1所述的一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位測試試劑盒，其特征在于：
所述試劑盒由下述體積分數組成的：磁分離試劑5％-7％，試劑R15％-7％，試劑R25％-7％，
標準品5％-7％，質控品1％-3％，校準品3％-6％，清洗濃縮液20％-40％，發光底物30％-50％。
3.根據權利要求2所述的一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位測試試劑盒，其特征在于：
所述試劑盒由下述體積分數組成的：磁分離試劑5％，試劑R15％，試劑R25％，校準品5％，
質控品1％，校準品3％，清洗濃縮液26％，發光底物50％。
4.根據權利要求2所述的一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位測試試劑盒，其特征在于：
所述試劑盒由下述體積分數組成的：磁分離試劑6％，試劑R16％，試劑R26％，校準品6％，
質控品2％，校準品4％，清洗濃縮液30％，發光底物40％。
5.根據權利要求2所述的一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位測試試劑盒，其特征在于：
所述試劑盒由下述體積分數組成的：磁分離試劑7％，試劑R17％，試劑R27％，校準品7％，
質控品3％，校準品6％，清洗濃縮液33％，發光底物30％。
6.根據權利要求1-5任一所述的一種游離人絨毛膜性腺激素β亞單位測試試劑盒，其特征
在于：所述試劑盒中各組分按照如下制備方法制得：
第一步：磁分離試劑的制備過程
一、磁珠緩沖液配制操作規程：
(1)稱取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，稱取0.96gTween-20于20ml容器中加
適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(2)用移液器將Proclin-300量取0.2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述
1L容器中；然后在1L容器中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；
(3)調節PH計測量其PH值；用4MHCl或4MNaOH調PH，測量其PH在7.95－8.05之間
即符合要求；
(4)稱取BSAV(牛血清白蛋白(第五組分))3g倒入上述1L容器中；
(5)最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7.95－8.05之間即符合要求，用0.2um濾器
過濾即得；過濾完后貼好標簽于2-8℃冷庫貯存；
二、磁分離試劑的配制：
(1)將1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亞胺)溶于50ulDMSO中，即濃度為20mg/mL；取
2mgF-β-hCG抗體溶于PH9.5的0.1mol/LPB緩沖液中至總體積為1ml；
(2)計算DSS的投入量，按照以下公式計算：(抗體質量/16000)×10×368/CDSS)，其中
CDSS指代DSS的物質的量濃度mol/L；
(3)用移液槍吸取相應體積的DSS加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min；
(4)將步驟3抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中,然后放入到sigma2-16k高速冷凍
離心機中在3000g的離心力下濃縮約30min至體積為0.5ml；
(5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直徑在0.9-1.5μm之間，加入5ml反應杯中，放入專用
試管架，經磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；
(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB，混勻30秒，上架，去上清，重復操作3次；
將步驟4獲得的抗體溶液加入到磁珠中，混勻后室溫反應4小時，保持混勻狀態；
(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分鐘，其中Tris的加樣量為1mg抗體加
0.15mlTris；
(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已經標記的磁珠，混勻30秒，上架，去上
清，重復操作3次；
(9)用100ml磁珠保存液將磁珠轉入125ml玻璃瓶，即為0.05％的F-β-hCG磁分離試劑；
(10)將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1：2.3的比例混勻，即得本發明試劑
盒中磁分離試劑；
第二步：試劑R1的制備過程
一、試劑R1稀釋液配制操作規程：
(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl20.05g于燒
瓶中；然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；
(2)用4MHCl或4MNaOH調PH，測量使PH在7.35-7.45范圍內；

【專利技術屬性】
技術研發人員：朱馳，王鍵，
申請(專利權)人：北京豪邁生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11