殺蟲晶體蛋白、核酸、殺蟲晶體蛋白的制備方法及其應用技術

本發明專利技術涉及殺蟲晶體蛋白領域，特別涉及對甜菜夜蛾、水稻二化螟、亞洲玉米螟和小菜蛾有殺蟲活性的Cry2類殺蟲晶體蛋白。

【技術實現步驟摘要】
殺蟲晶體蛋白、核酸、殺蟲晶體蛋白的制備方法及其應用
本專利技術涉及殺蟲晶體蛋白領域，特別涉及對鱗翅目有殺蟲活性的Cry2類殺蟲晶體蛋白。
技術介紹
到目前為止，已經發現了約600種的殺蟲晶體蛋白，這些殺蟲晶體蛋白主要來源于蘇云金芽孢桿(Bacillusthuringiensis)。其對9個目500多種昆蟲以及線蟲、螨類和多種原生動物具有殺蟲活性。由于Bt殺蟲活性廣泛并且與化學農藥相比專一性高、安全性好、防治效果好、不污染環境等優點，已經成為目前世界上研究最多，應用最廣、最成功的昆蟲病原微生物，Bt殺蟲劑占生物農藥的70％以上，并已經應用于轉基因植物，為人類帶來很好的經濟和生態效益，對其研究還在不斷擴展和深入。但是殺蟲晶體蛋白的專一性強的特點是一把雙刃劍。一方面其專一性強，意味著其對除目標害蟲以外的生物，特別是人畜安全；但是另一方面也使得其殺蟲譜過窄，對于多種害蟲的綜合防治來說，需要開發出針對不同害蟲有效的殺蟲晶體蛋白才能達到防治的目的。然而，現有技術中僅發現蘇云金芽孢桿菌的營養期殺蟲蛋白(Vip蛋白，一種不同于殺蟲晶體蛋白的蛋白)對甜菜夜蛾有較好的活性，而在殺蟲晶體蛋白中至今還未發現能夠對甜菜夜蛾等具有較好活性的蛋白。因此，有必要從已知或新分離的蘇云金芽孢桿菌菌株中尋找能夠對甜菜夜蛾等有較好的活性殺蟲晶體蛋白。
技術實現思路
本專利技術之一提供了一種殺蟲晶體蛋白，其為Cry2類蛋白，所述Cry2類蛋白包括Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一種；其中，所述Cry2Aa17的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述Cry2Ab29的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述Cry2Ba2的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；所述Cry2Aa9的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，所述Cry2Ab4的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，所述Cry2Ah1的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。其中，由于氨基酸序列與殺蟲活性之間并不是簡單的一一對應關系，有的氨基酸序列高度同源但殺蟲活性卻有很大的不同。隨著新基因的不斷發現，一種基因具有兩種或多種活性的情況不斷被發現，為了避免殺蟲譜和氨基酸序列的不一致性，Crickmore等提出了一種根據氨基酸序列同源性進行分類，形成了一個開放式分類系統，共分為四級，殺蟲晶體蛋白氨基酸序列的同源性小于45％為第一等級；在45％-78％之間為第二等級；在78％-95％之間為第三等級；同源性在95％以上為第四等級。其中第一、第四等級用阿拉伯數表示；第二、第三等級分別用大、小寫英文字母表示。只要是來自Bt的伴胞晶體蛋白(又稱為殺蟲晶體蛋白)，對目標生物具有毒性，或與已知的Cry或Cyt蛋白具有很高同源性，就可以納入這一分類系統。按照Crickmore等提出的基因分類系統，Cry蛋白約70類，本專利技術的Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1之間的同源性在45％-78％之間。現有研究證實，殺蟲晶體蛋白原毒素大小約130kDa，但其在130kDa大小的狀態下并沒有殺蟲活性，而是必須經過蛋白酶等作用的切割，切割得到約52-68kDa的蛋白后才能夠發揮其活性。其中，所述的切割可以一般發生在有害生物的腸道之內，但也可以人為地有目的地改造為具有相同功能的52-68kDa的蛋白。因此，在一個具體實施例中，所述殺蟲晶體蛋白為利用胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶消化所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一種之后獲得的52-68kDa的蛋白；優選所述殺蟲晶體蛋白為利用胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶消化所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一種之后獲得的55-65kDa的蛋白；特別優選所述52-68kDa的蛋白或所述55-65kDa的蛋白與Cry2類蛋白具有相同的功能。在此所述的Cry2類蛋白包括Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一種；其中，所述Cry2Aa17的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述Cry2Ab29的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述Cry2Ba2的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；所述Cry2Aa9的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，所述Cry2Ab4的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，所述Cry2Ah1的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。其中，例如與殺蟲蛋白Cry2Aa9、Cry2Ab4或Cry2Ah1的相同的功能可以為在防治甜菜夜蛾和/或水稻二化螟中的應用；與殺蟲蛋白Cry2Aa17、Cry2Ab29、或Cry2Ba2的相同的功能可以為在防治甜菜夜蛾、亞洲玉米螟和小菜蛾中的應用。在一個具體實施例中，所述殺蟲晶體蛋白為所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一種的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或多個氨基酸的與所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一種具有相同功能的蛋白；優選所述殺蟲晶體蛋白為mCry2Aa17，所述mCry2Aa17的氨基酸序列為經如SEQIDNo.14所示核酸序列翻譯后得到的氨基酸序列。本專利技術之二提供了一種能夠翻譯為如上的本專利技術所述的殺蟲晶體蛋白的核酸。在一個具體實施例中，能夠翻譯為所述Cry2Aa17的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.8所示，能夠翻譯為所述Cry2Ab29的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.9所示，能夠翻譯為所述Cry2Ba2的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.10所示，能夠翻譯為所述Cry2Aa9的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.11所示，能夠翻譯為所述Cry2Ab4的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.12所示，和能夠翻譯為所述Cry2Ah1的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.13所示，能夠翻譯為所述mCry2Aa17的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.14所示。這些基因的序列可以從Bt菌株中克隆出來，也可以人工合成。本專利技術之三提供了一種制備如上的本專利技術所述的殺蟲晶體蛋白的方法，其包括如下步驟：在活體生物中表達上述殺蟲晶體蛋白；優選在含有如上的本專利技術所述的核酸序列的活體生物中表達所述殺蟲晶體蛋白。本專利技術之四提供了一種制備殺蟲晶體蛋白的方法，其包括如下步驟：在16-20℃下表達殺蟲晶體蛋白。在一個具體實施例中，所述殺蟲晶體蛋白為Cry1-70類蛋白中的至少一種，例如表1中的蛋白中的至少一種；優選為Cry1類蛋白、Cry2類蛋白、Cry3類蛋白和Cry8類蛋白中的至少一種，更優選的為在含有能夠翻譯為如上的本專利技術所述的殺蟲晶體蛋白的核酸，或更具體的講在含有SEQIDNo.8、如SEQIDNo.9所示、如SEQIDNo.10所示、如SEQIDNo.11所示、如SEQIDNo.12、如SEQIDNo.13所示和如SEQIDN本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種殺蟲晶體蛋白，其為Cry2類蛋白，所述Cry2類蛋白包括Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一種；其中，所述Cry2Aa17的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，所述Cry2Ab29的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，所述Cry2Ba2的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示；所述Cry2Aa9的氨基酸序列如SEQ?ID?No.4所示，所述Cry2Ab4的氨基酸序列如SEQ?ID?No.5所示，所述Cry2Ah1的氨基酸序列如SEQ?ID?No.6所示。

【技術特征摘要】
1.一種殺蟲晶體蛋白，其為Cry2類蛋白，所述Cry2類蛋白包括Cry2Aa17、Cry2Ab29、mCry2Aa17、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一種；其中，所述Cry2Aa17的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述Cry2Ab29的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述Cry2Ab4的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，所述Cry2Ah1的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示，所述mCry2Aa17的氨基酸序列為經如SEQIDNo.14所示核酸序列翻譯后得到的氨基酸序列。2.一種能夠翻譯為如權利要求1所述的殺蟲晶體蛋白的核酸。3.根據權利要求2所述的核酸，其特征在于，能夠翻譯為所述Cry2Aa17的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.8所示，能夠翻譯為所述Cry2Ab29的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.9所示，能夠翻譯為所述Cry2Ab4的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.12所示，和能夠翻譯為所述Cry2Ah1的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.13所示，能夠翻譯為所述mCry2Aa17的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.14所示。4.根據權利要求1所述的殺蟲晶體蛋白在防治有害生物中的應用，其中，Cry2Aa17對甜菜夜蛾、亞洲玉米螟和小菜蛾中的一種有活性；mCry2Aa17對甜菜夜蛾、亞洲玉米螟和小菜蛾中的一種有活性；Cry2Ab...

【專利技術屬性】
技術研發人員：束長龍，張杰，張風嬌，彭琦，宋福平，耿麗麗，
申請(專利權)人：中國農業科學院植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11