融合殺蟲蛋白Cry1Am、其編碼基因及應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種新型的融合殺蟲蛋白Cry1Am及其編碼基因，該融合殺蟲蛋白對(duì)野生型和Cry1Ab/Cry1Ac抗性昆蟲具有高殺蟲活性，可以用于殺死亞洲玉米螟等鱗翅目害蟲，提高轉(zhuǎn)基因作物的殺蟲能力。而且該融合殺蟲蛋白可以有效殺死對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性的玉米螟，能用于昆蟲抗性防治。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種融合殺蟲蛋白CrylAm、其編碼基因 及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
蟲害是造成農(nóng)作物嚴(yán)重減產(chǎn)的一個(gè)主要因素，防治農(nóng)業(yè)害蟲最常見的手段就是使 用廣譜化學(xué)殺蟲劑和一些生物殺蟲劑。化學(xué)殺蟲劑多具有廣譜、高毒的特點(diǎn)，在殺死目標(biāo) 害蟲的同時(shí)往往將很多益蟲一起殺死，嚴(yán)重破壞生態(tài)平衡，并對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染；另一方 面，農(nóng)藥殘留對(duì)人類、牲畜的健康也造成嚴(yán)重威脅。生物殺蟲劑具有易降解、與環(huán)境高度相 容的特點(diǎn)，但在生產(chǎn)上需要重復(fù)施用，大大增加生產(chǎn)成本。為了彌補(bǔ)化學(xué)殺蟲劑和生物殺蟲 劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中的弊端，科學(xué)家們將編碼殺蟲蛋白的基因?qū)氲街参矬w內(nèi)，培育出多 種轉(zhuǎn)基因植物。自1996年至今，已經(jīng)有多種轉(zhuǎn)Bt基因殺蟲作物獲得批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)， 但這些抗蟲轉(zhuǎn)基因作物多使用CrylA類殺蟲蛋白基因，殺蟲蛋白基因的單一化、大面積使 用加速害蟲抗性的產(chǎn)生，制約了轉(zhuǎn)CrylA類抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用年限。因此，需要不斷尋 找具有高殺蟲能力、而且能延緩害蟲抗性產(chǎn)生的新型基因。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種對(duì)野生型和CrylAb/CryIAc抗性昆蟲具有高殺蟲能力 的新型融合殺蟲蛋白CrylAm及其編碼基因。 本專利技術(shù)的另一目的是提供所述新型融合殺蟲蛋白CrylAm及其編碼基因的應(yīng)用。 為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的一種融合殺蟲蛋白CrylAm，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基 酸序列。 本專利技術(shù)還提供上述融合殺蟲蛋白的編碼基因，基因 CrylAm包括編碼CrylAb上游 658個(gè)氨基酸的核苷酸序列、編碼30個(gè)氨基酸融合肽段的核苷酸序列、編碼CrylIa蛋白結(jié) 構(gòu)域III的核苷酸序列、編碼CrylIe蛋白結(jié)構(gòu)域I和II的核苷酸序列。 本專利技術(shù)還根據(jù)玉米密碼子的偏好性，對(duì)編碼上述融合殺蟲蛋白的基因 CrylAm進(jìn) 行改造合成，所述基因的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。 應(yīng)當(dāng)理解的是，由于密碼子具有簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子所具有的偏愛性，本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。在本專利技術(shù)中，所述核苷酸序 列采用了玉米偏愛性密碼子。 本專利技術(shù)還提供了含有所述基因的表達(dá)載體，其中，所述表達(dá)載體包括誘導(dǎo)表達(dá)載 體和植物表達(dá)載體。 本專利技術(shù)還提供了含有所述基因的宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和工程菌。 本專利技術(shù)還提供了所述基因在提高植物抗蟲性中的應(yīng)用。 進(jìn)一步地，所述應(yīng)用是在植物體內(nèi)表達(dá)所述融合殺蟲蛋白的編碼基因，提高植物 的抗害蟲能力。 進(jìn)一步地，所述植物包括玉米、水稻、棉花、大豆、高粱等。 進(jìn)一步地，所述害蟲為鱗翅目害蟲，包括但不限于亞洲玉米螟、棉鈴蟲和粘蟲等。 本專利技術(shù)還提供了所述基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。 本專利技術(shù)提供的融合殺蟲蛋白CrylAm，對(duì)野生型和CrylAb/CryIAc抗性昆蟲具有高 殺蟲活性，可以用于殺死亞洲玉米螟等鱗翅目害蟲，提高轉(zhuǎn)基因作物的殺蟲能力。而且該融 合殺蟲蛋白可以有效殺死對(duì)CryIAc蛋白產(chǎn)生抗性的玉米螟，能用于昆蟲抗性防治。【附圖說明】 圖1為本專利技術(shù)實(shí)施例1中構(gòu)建的含有融合殺蟲蛋白CrylAm的編碼基因的誘導(dǎo)表 達(dá)載體pET30a-CrylAm的質(zhì)粒圖譜。 圖2為本專利技術(shù)實(shí)施例4中改造的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301的質(zhì)粒圖譜。 圖3為本專利技術(shù)實(shí)施例4中含有融合殺蟲蛋白基因的p3301Ubi-CrylAm植物表達(dá)載 體圖。 圖4為本專利技術(shù)實(shí)施例6中試紙條檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米中融合殺蟲蛋白CrylAm的表達(dá)； 其中，1，非轉(zhuǎn)基因玉米；2-5,轉(zhuǎn)基因玉米。 圖5為本專利技術(shù)實(shí)施例7中轉(zhuǎn)基因玉米溫室接蟲鑒定結(jié)果。【具體實(shí)施方式】 以下實(shí)施例用于說明本專利技術(shù)，但不用來限制本專利技術(shù)的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。 實(shí)施例1融合殺蟲蛋白編碼基因 CrylAm誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建 融合殺蟲蛋白CrylAm的編碼基因，包括編碼CrylAb上游658個(gè)氨基酸的核苷酸 序列、編碼30個(gè)氨基酸融合肽段的核苷酸序列、編碼CrylIa蛋白結(jié)構(gòu)域III的核苷酸序 列、編碼CrylIe蛋白結(jié)構(gòu)域I和II的核苷酸序列。所述融合殺蟲蛋白CrylAm的氨基酸序 列如Seq ID No. 1所示。根據(jù)玉米密碼子的偏好性，對(duì)編碼融合殺蟲蛋白CrylAm的基因進(jìn) 行改造合成，基因 CrylAm的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示，基因序列委托上海生工合成 并構(gòu)建到PUC57載體上，構(gòu)建得到具有氨芐青霉素抗性的質(zhì)粒pUC57-CrylAm。 將質(zhì)粒pUC57_CrylAm及質(zhì)粒pET30a(購自美國(guó)Novagen公司）各取20ng加入 到50 μ L大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5 α中，冰浴30min ;42°C熱激90sec，冰浴2min ;加入 300 μ L LB液體培養(yǎng)基，37°C低速振蕩恢復(fù)培養(yǎng)Ihr后，將菌液涂于含相應(yīng)抗生素的平板 上，晾干；37°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15hr。挑取單克隆菌斑于IOmL含氨芐青霉素的LB液體培 養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩過夜培養(yǎng)，次日，按照天根生化科技（北京）有限公司質(zhì)粒小提中量 提取試劑盒操作步驟提取質(zhì)粒，并用NanoDrop 2000C微量紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的質(zhì)粒 定量。 選擇在質(zhì)粒上有單一酶切位點(diǎn)且恰好位于基因兩端的限制性內(nèi)切酶BamHI和 HindIII雙酶切質(zhì)粒pUC57-CrylAm及pET30a，使基因與載體的兩端具有相同的粘性末端。 pUC57-CryIAm酶切后，經(jīng)瓊脂糖膠電泳，對(duì)照Marker分別切取約4. 2kb大小的片段，用天根 生化科技（北京）有限公司膠回收試劑盒對(duì)核酸片段進(jìn)行回收；質(zhì)粒pET30a經(jīng)雙酶切后用 天根生化科技（北京）有限公司純化試劑盒進(jìn)行純化回收。然后，按照T4連接酶的使用說 明將切膠回收的核酸片段與純化回收的載體片段進(jìn)行連接，即構(gòu)建獲得含有融合殺蟲蛋白 CrylAm的編碼基因的誘導(dǎo)表達(dá)載體pET30a-CryIAm(圖1)。連接反應(yīng)結(jié)束，取5 μ L連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5 α，方法同上。 挑取克隆菌斑于IOmL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩過夜培養(yǎng)， 次日，提質(zhì)粒并定量。用BamHI和HindIII雙酶切質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖電泳驗(yàn)證殺蟲蛋白基因與 pET30a酶切位點(diǎn)連接的正確性。 實(shí)施例2融合殺蟲蛋白CrylAm的誘導(dǎo)與純化 將測(cè)序并酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒pET30a-Cry I Am轉(zhuǎn)入購自全式金公司的菌株 Transetta(DE3)中，挑取單克隆，PCR擴(kuò)增驗(yàn)證陽性菌斑。將檢測(cè)陽性的菌斑接種于IOmL的 LB液體培養(yǎng)基中（含適宜抗生素），于37°C過夜振蕩培養(yǎng)。將含有pET30a-CrylAm質(zhì)粒的 大腸桿菌菌株Transetta (DE3)，按1:100接種到IOmL LB液體培養(yǎng)基中（含適宜抗生素）， 同樣于37°C過夜振蕩培養(yǎng)。 次日，按1:200接種到200mL LB液本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
融合殺蟲蛋白Cry1Am，其特征在于，其氨基酸序列如Seq?ID?No.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉允軍，王國(guó)英，張煜文，劉艷，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11