本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)包括：（a）如SEQ?ID?NO:2所示的第1-650位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或（b）具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或（c）在（a）或（b）中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有殺蟲(chóng)活性的由（a）或（b）衍生的蛋白質(zhì)；或（d）與（a）或（b）中的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明專利技術(shù)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)不僅表達(dá)量高且穩(wěn)定性好，對(duì)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的毒力強(qiáng)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，特別是涉及一種改造的PIC6-02t殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途。
技術(shù)介紹
植物蟲(chóng)害是導(dǎo)致農(nóng)作物損失的主要因素，給農(nóng)民造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至影響到當(dāng)?shù)厝丝诘纳鏍顩r。為了防治植物蟲(chóng)害，人們通常使用廣譜化學(xué)殺蟲(chóng)劑和生物殺蟲(chóng)制齊U，但二者在實(shí)際應(yīng)用中都具有局限性化學(xué)殺蟲(chóng)劑會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染的問(wèn)題，并導(dǎo)致抗藥性昆蟲(chóng)的出現(xiàn)；而生物殺蟲(chóng)制劑在環(huán)境中容易降解，在生產(chǎn)上需要重復(fù)施用，大大增加了生產(chǎn)成本。為了解決化學(xué)殺蟲(chóng)劑和生物殺蟲(chóng)制劑在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，科學(xué)家們經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)將編碼殺蟲(chóng)蛋白的抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲(chóng)害。PIC6殺蟲(chóng)蛋白是眾多殺蟲(chóng)蛋白中的一種，是由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的伴胞結(jié)晶蛋白。PIC6蛋白被昆蟲(chóng)攝入進(jìn)入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲(chóng)中腸的堿性PH環(huán)境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉(zhuǎn)變成活性片段；活性片段和昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞膜上表面上受體結(jié)合，插入腸膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)穿孔病灶，破壞細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲(chóng)的消化過(guò)程，最終導(dǎo)致其死亡。每年因植物蟲(chóng)害造成的糧食損失巨大，例如小菜蛾、玉米螟、棉鈴蟲(chóng)、東方黏蟲(chóng)或二化螟等。目前未發(fā)現(xiàn)PIC6殺蟲(chóng)蛋白在植物中的表達(dá)水平和毒力的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，所述PIC6_02t殺蟲(chóng)蛋白在植物中(尤其為玉米)具有較高的表達(dá)量和毒力。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供了一種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)，包括(a)如SEQ ID NO:2所示的第1_650位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(C)在(a)或(b)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有殺蟲(chóng)活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)；或(d)與(a)或(b)中的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步地，所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)為與SEQ ID NO: 2的第1_650位具有至少95%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或與SEQ ID N0:2具有至少95%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。更進(jìn)一步地，所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)為與SEQ ID NO: 2的第1-650位具有至少99%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或與SEQ ID N0:2具有至少99%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供了一種殺蟲(chóng)基因，包括Ca)編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或(b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或(c)具有SEQ ID NO:1的第1-1950位所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。所述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0· 5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜I次。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種表達(dá)盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控 下的所述殺蟲(chóng)基因。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種包含所述殺蟲(chóng)基因或所述表達(dá)盒的重組載體。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種包含所述殺蟲(chóng)基因或所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物，包括植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、線蟲(chóng)或藻類。進(jìn)一步地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻、小麥、高粱、牧草或甘蔗。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種產(chǎn)生殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的方法，包括獲得所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞；在允許產(chǎn)生殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞；回收所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種用于增加昆蟲(chóng)靶范圍的方法，包括將所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的第二種殺蟲(chóng)核苷酸一起表達(dá)。進(jìn)一步地，所述第二種殺蟲(chóng)核苷酸可以編碼Cry類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過(guò)氧化物酶。可選擇地，所述第二種殺蟲(chóng)核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中重要基因的dsRNA。在本專利技術(shù)中，PIC6_02t殺蟲(chóng)蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個(gè)或多個(gè)Cry類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過(guò)一種的殺蟲(chóng)毒素在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達(dá)可以通過(guò)遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物(第I親本)可以通過(guò)遺傳工程操作表達(dá)PIC6-02t殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)，第二種植物(第2親本)可以通過(guò)遺傳工程操作表達(dá)Cry類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。通過(guò)第I親本和第2親本雜交獲得表達(dá)引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。因此可以使用RNAi技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種產(chǎn)生抗蟲(chóng)植物的方法，包括將所述殺蟲(chóng)基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物。優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻、小麥、高粱、牧草或甘蔗。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種用于保護(hù)植物免受由昆蟲(chóng)害蟲(chóng)引起的損傷的方法，包括將所述的殺蟲(chóng)基因或所述的表達(dá)盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護(hù)其免受昆蟲(chóng)害蟲(chóng)侵害量的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻、小麥、高粱、牧草或甘蔗。將所述的殺蟲(chóng)基因或所述的表達(dá)盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，在本專利技術(shù)中為將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種控制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的方法，包括使昆蟲(chóng)害蟲(chóng)與抑制量的所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)或由所述殺蟲(chóng)基因編碼的昆蟲(chóng)抑制性蛋白接觸。優(yōu)選地，所述昆蟲(chóng)害蟲(chóng)是鱗翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種由包含所述殺蟲(chóng)基因的核苷酸序列編碼的雜合殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述雜合殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)是由如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列編碼的。本專利技術(shù)中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。本專利技術(shù)中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到，可以將本專利技術(shù)的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。由于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了 DNA的其它互補(bǔ)鏈。這樣，本專利技術(shù)包括對(duì)序列表中示例的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補(bǔ)鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實(shí)際上是從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的。“有義”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個(gè)核苷酸，一次讀三個(gè)可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開(kāi)放閱讀框(ORF)閱讀來(lái)形成本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)，其特征在于，包括：（a）如SEQ?ID?NO:2所示的第1?650位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或（b）如SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或（c）在（a）或（b）中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有殺蟲(chóng)活性的由（a）或（b）衍生的蛋白質(zhì)；或（d）與（a）或（b）中的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張愛(ài)紅，程鵬，楊旭，韓超，張?jiān)浦?/a>，王飛鵬，楊秋妹，王小藝，李濤，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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