一種從煤層水樣中提取微生物總DNA的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種從煤層水樣中提取微生物總DNA的方法，屬于煤層水樣微生物分析。本發(fā)明專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是從成分復雜的煤層水樣中提取微生物總DNA的方法。本發(fā)明專利技術(shù)方法包括以下步驟：煤層水樣的預(yù)處理，通過離心去除大顆粒雜質(zhì)，采用膜過濾的方式收集水樣中的微生物；微生物細胞破碎，將收集好微生物的濾膜剪碎后重懸在緩沖液中，用珠磨器法破碎細胞，再用蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉溶液在55℃孵育2h?4h，至溶液澄清；微生物總DNA的純化和沉淀，用酚?氯仿法去除雜蛋白，加入異丙醇沉淀收集總DNA。本發(fā)明專利技術(shù)的總DNA提取方法適合于成分復雜的煤層水樣及相關(guān)樣品，細胞破碎效果好，提取的基因組純度高、完整性好，可直接用于后續(xù)的宏基因組學分析、DGGE分析等。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種從煤層水樣中提取微生物總DNA的方法
：本專利技術(shù)屬于分子生物學
，具體涉及從煤層水樣中提取微生物總DNA的方法。
技術(shù)介紹
：煤層氣是成煤過程中生成的非常規(guī)天然氣，是一種潔凈的化石能源。據(jù)國際能源機構(gòu)(IEA)估計，全世界煤層氣資源量達263.8×1012m3，其中我國煤層氣資源量約30×1012-36.81×1012m3，開發(fā)潛力巨大。煤層氣的開發(fā)不僅可以改善我國能源以煤炭為主，石油供給不足的格局，而且有助于煤礦的安全開采，減少溫室氣體排放，改善大氣環(huán)境。煤層氣按其成因可分為生物成因氣、熱成因氣或混合成因氣。其中，生物成因氣是以微生物為產(chǎn)氣主體。近年來，美國、加拿大等國家在生物成氣方面開展的大量研究，其中，解析產(chǎn)氣微生物群落的結(jié)構(gòu)有助于掌握功能微生物的類型，為實現(xiàn)調(diào)控微生物成氣奠定理論基礎(chǔ)。我國目前也在煤層氣生物成氣方面開展了一些工作，鑒于煤層微生物中存在大量極端且不可培養(yǎng)的微生物，常規(guī)分離培養(yǎng)等分析方法無法確定微生物的種類與豐度。宏基因組學、分子指紋圖譜技術(shù)等免培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，為揭開不可培養(yǎng)微生物的神秘面紗提供了技術(shù)支撐。因此，高質(zhì)量的微生物基因組提取方法成為決定數(shù)據(jù)準確全面的關(guān)鍵。由于煤層水樣組成復雜，水樣中除了含有煤顆粒外，還存在大量理化性質(zhì)復雜的物質(zhì)，目前還沒有一種適合煤層水樣中微生物基因組高效提取的方法。當前煤層水樣品中微生物總DNA的提取多數(shù)采用試劑盒法，但是并沒有針對煤層水樣品的專用試劑盒，由于樣品中腐殖酸、吸附性顆粒等雜質(zhì)的影響，采用高溫及化學法來破壁的試劑盒的缺陷在于菌體細胞破碎并不徹底。已經(jīng)公布的類似的基因組提取專利，如中國專利《一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法》(申請?zhí)枺?01410186729.2)，中國專利《一種煤層氣田地下水微生物檢測方法》(申請?zhí)枺?01110005095.2)，其中涉及DNA提取的方法采用的是試劑盒法，而中國專利《煤礦酸性礦井水底泥DNA提取方法》(申請?zhí)枺?00810231369.8)，中國專利《一種礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法》(專利號：CN103642798A)，由于樣品性質(zhì)和組成與煤層水樣有較大差異，上述方法并不適用于煤層水樣中的微生物基因組的提取。因此，開發(fā)適合于煤層水樣中微生物總DNA的提取方法對于研究煤層氣田微生物群落結(jié)構(gòu)與豐度具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
：本專利技術(shù)的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，建立一種適合從成分復雜的煤層水樣中高效提取微生物的總DNA的方法，解決基因組提取過程中細胞破碎的關(guān)鍵步驟，采用珠磨器機械破碎、化學破碎與酶消化相結(jié)合的方法。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：一種從煤層水樣中提取微生物總DNA的方法，包括如下步驟：1)煤層水樣的預(yù)處理：取煤層水樣10-20mL通過低速離心去除大顆粒雜質(zhì)，收集上清液，采用抽濾的方式將水樣中的微生物收集到濾膜上，將濾膜剪碎后置于STE緩沖液中，待用；所述STE緩沖液組成包括：NaCl0.1-0.2g/L，Tris-HCl20-40mmol/L，EDTA0.3-0.6mol/L，溶劑為ddH2O；2)微生物細胞的破碎：將含有濾膜的緩沖液移入含有玻璃珠的預(yù)冷螺旋帽管中，用珠磨器對細胞進行破碎，重復2-3次，重復過程中將上清液移至離心管后，再向螺旋帽管加滿STE緩沖液，將所有上清液合并，加入蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉(SDS)水溶液，充分混勻后置于55℃水浴鍋內(nèi)孵育2-4h；3)微生物DNA的抽提、純化及沉淀：向孵育后的液體中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，11000-13000×g離心10-30min，取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液抽提，除去酚類物質(zhì)和脂類物質(zhì)，11000-13000×g離心10-30min，收集上清液，加入1-2倍體積的異丙醇，于-20℃低溫沉淀1-2h，用預(yù)冷的75％乙醇洗滌沉淀，11000-13000×g離心10-30min，棄上清，室溫放置至乙醇揮發(fā)完全后，加入50-150μL的TE緩沖液溶解沉淀，溶解后加入RNaseA去除RNA，得到微生物基因組總DNA。其中，步驟1)所述去通過低速離心去除大顆粒雜質(zhì)，離心轉(zhuǎn)速為1000-2500×g，離心時間為5-10min。其中，步驟1)所述濾膜置于的STE緩沖液的體積為5-10mL。其中，步驟1)所述采用抽濾方式將水樣中的微生物收集到濾膜上，濾膜孔徑為0.22μm。其中，步驟2)玻璃珠的添加量為0.6-0.8g，玻璃珠直徑為0.3mm。其中，步驟2)所述珠磨器轉(zhuǎn)速為1500-3500rpm，破碎時間15-45s。其中，步驟2)所述蛋白酶K的終濃度為20-50mg/mL，SDS的質(zhì)量體積比為5％-10％。其中，步驟1)所述的煤層水樣可以用煤炭厭氧發(fā)酵液替代。本專利技術(shù)所述方法從煤層水樣和煤炭厭氧發(fā)酵液中提取得到的微生物總DNA，濃度和純度較高，經(jīng)檢測微生物總DNA的完整性較好，可直接用于宏基因組高通量測序和DGGE分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比本專利技術(shù)的有益效果：1.本專利技術(shù)的微生物總DNA提取方法適用于煤層水樣、煤炭厭氧發(fā)酵液等。2.本專利技術(shù)的方法采用低速離心去除煤層水樣中的大顆粒雜質(zhì)，根據(jù)樣品特點，使用珠磨器機械振蕩破碎、化學法和酶消化的方法高效地實現(xiàn)了微生物總DNA的提取，得到的基因組的完整性較好，純度和濃度較高，所需試劑均可從公司直接購買。3.本專利技術(shù)所述的DNA提取方法適合于從煤層水樣中提取出古菌和細菌的總基因組，通過珠磨器法可以快速高效地完成微生物細胞的破壁，化學法和酶消化法有助于去除雜蛋白、腐殖酸等雜質(zhì)。本方法提取得到的總DNA片段完整性較好、純度高，可直接用于后續(xù)的宏基因組學分析、DGGE(變性梯度凝膠電泳)分析和PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))擴增。附圖說明：圖1為本專利技術(shù)方法提取的煤層水樣微生物總DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；其中泳道M為DNAmarkerλDNA-HindⅢ，泳道1為煤層水樣微生物總DNA。圖2為某公司試劑盒提取煤層水樣總DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中泳道M為DNAmarkerλDNA-HindⅢ，泳道1-3分別為三個不同煤層水樣中總DNA的提取結(jié)果。圖3為本專利技術(shù)方法提取的煤層水樣和煤炭厭氧發(fā)酵后的水樣微生物總DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M為DNAmarkerλDNA-HindⅢ，泳道1和2為煤層水樣微生物總DNA，泳道3和4為煤炭厭氧發(fā)酵后的水樣微生物總DNA。圖4為煤層水樣提取DNA擴增細菌16SrDNA片段瓊脂糖電泳圖；其中泳道1和2為本專利技術(shù)方法提取的微生物總DNA擴增得到的細菌16SrDNA片段，泳道3和4為公司試劑盒提取的微生物總DNA擴增得到的細菌16SrDNA片段。圖5為不同方法提取煤層水樣中微生物總DNA擴增古菌16SrDNA片段的瓊脂糖電泳圖；其中泳道1-3為公司試劑盒提取的微生物總DNA擴增得到的古菌16SrDNA片段，泳道4-7為本專利技術(shù)方法提取的微生物總DNA擴增得到的古本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種從煤層水樣中提取微生物總DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：1)煤層水樣的預(yù)處理：取煤層水樣10?20mL通過低速離心去除大顆粒雜質(zhì)，收集上清液，采用抽濾的方式將水樣中的微生物收集到濾膜上，將濾膜剪碎后置于STE緩沖液中，待用；所述STE緩沖液組成包括：NaCl?0.1?0.2g/L，Tris?HCl?20?40mmol/L，EDTA?0.3?0.6mol/L，溶劑為ddH2O；2)微生物細胞的破碎：將含有濾膜的緩沖液移入含有玻璃珠的預(yù)冷螺旋帽管中，用珠磨器對細胞進行破碎，重復2?3次，重復過程中將上清液移至離心管后，再向螺旋帽管加滿STE緩沖液，將所有上清液合并，加入蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉水溶液，充分混勻后置于55℃水浴鍋內(nèi)孵育2?4h；3)微生物DNA的抽提、純化及沉淀：向孵育后的液體中加入等體積的酚?氯仿?異戊醇混合液，11000?13000×g離心10?30min，取上清液，加入等體積的氯仿?異戊醇混合液抽提，除去酚類物質(zhì)和脂類物質(zhì)，11000?13000×g離心10?30min，收集上清液，加入1?2倍體積的異丙醇，于?20℃低溫沉淀1?2h，用預(yù)冷的75％乙醇洗滌沉淀，11000?13000×g離心10?30min，棄上清，室溫放置至乙醇揮發(fā)完全后，加入50?150μL的TE緩沖液溶解沉淀，溶解后加入RNaseA去除RNA，得到微生物基因組總DNA。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種從煤層水樣中提取微生物總DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：
1)煤層水樣的預(yù)處理：取煤層水樣10-20mL通過低速離心去除大顆粒雜質(zhì)，低速離心轉(zhuǎn)速為1000-2500×g，離心時間為5-10min，收集上清液，采用抽濾的方式將水樣中的微生物收集到孔徑為0.22μm的濾膜上，將濾膜剪碎后置于5-10mLSTE緩沖液中，待用；所述STE緩沖液組成包括：NaCl0.1-0.2g/L，Tris-HCl20-40mmol/L，EDTA0.3-0.6mol/L，溶劑為ddH2O；
2)微生物細胞的破碎：將含有濾膜的緩沖液移入預(yù)冷的螺旋帽管中，向螺旋帽管中添加質(zhì)量為0.6-0.8g、直徑為0.3mm的玻璃珠，采用珠磨器對細胞進行破碎，珠磨器的轉(zhuǎn)速為1500-3500rpm，破碎時間15-45s，重復2-3次，重復過程中將上清液移至離心管后，再向螺旋帽管加滿STE緩沖液，...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊秀清，吳瑞薇，聶志強，王保玉，韓作穎，
申請(專利權(quán))人：山西大學，易安藍焰煤與煤層氣共采技術(shù)有限責任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：山西;14