一種靶向CD30的復制缺陷性重組慢病毒CAR-T轉基因載體及其構建方法和應用技術

本發明專利技術公開了一種靶向CD30的復制缺陷性重組慢病毒的CAR?T轉基因載體，包括：用于質粒復制的原核復制子pUC?Ori序列；用于目的菌株大量擴增的含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列；用于增強真核細胞內的復制的病毒復制子SV40Ori序列；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；用于真核細胞表達綠色熒光的ZsGreen1綠色熒光蛋白；用于共同轉錄表達蛋白質的IRES核糖體結合序列；用于嵌合抗原受體基因的真核轉錄的人EF1α啟動子；用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體；用于增強轉基因的表達效率的eWPRE元件。此外，還公開了該載體的構建方法和應用。本發明專利技術能顯著提高細胞因子的分泌、CAR?T細胞的體外殺傷作用，臨床治療霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤效果突出。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于醫學生物領域，具體涉及一種載體，尤其涉及一種靶向CD30的復制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉基因載體。此外，本專利技術還涉及該載體的構建方法和應用。
技術介紹
腫瘤免疫治療的理論基礎是免疫系統具有識別腫瘤相關抗原、調控機體攻擊腫瘤細胞(高度特異性的細胞溶解)的能力。這個生物過程十分復雜，目前仍處于研究之中。上世紀90年代，多個科研小組已經發現了腫瘤抗原(tμmor antigens)，T淋巴細胞可以通過主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)依賴性方式識別這些腫瘤抗原。腫瘤免疫治療通常分為兩類，非特異性免疫和特異性免疫。非特異性免疫治療主要包括白細胞介素-2(interleμkin-2，IL-2)，干擾素α(interferonα，IFN-α)，腫瘤壞死因子(tμmor necrosis factor，TNF-α)，卡介苗等細胞因子和毒素，過繼性細胞免疫治療等。特異性免疫治療主要是腫瘤疫苗。1.1腫瘤非特異性免疫治療非特異性免疫應答是與生俱來的，它的形成并不需要抗原刺激，能廣泛地針對多種抗原，是免疫應答的基礎，但特異性不強，對某種特定抗原物質往往不能產生足夠強度的反應非特異性的免疫治療。在進入臨床試驗的多種細胞因子中，白細胞介素-2和干擾素應用最為廣泛[Rosenberg S A，Lotze M T，Mμμl L M，et al.A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancerμsing lymphokine-activated killer cells and interleμkin-2 or high-dose interleμkin-2 alone[J].N Engl J Med，1987，316(15):889－897.]。1.2腫瘤單克隆抗體的免疫治療近20多年來單克隆抗體已在腫瘤治療領域得到廣泛應用。抗腫瘤單抗藥物一般包括兩類：一是抗腫瘤單抗，二是抗腫瘤單抗偶聯物，或稱免疫偶聯物。免疫偶聯物分子由單抗與“彈頭”藥物兩部分組成，“彈頭”主要包括放射性核素、藥物和毒素，與單抗連接后分別構成放射免疫偶聯物、化學免疫偶聯物和免疫毒素。在1997年11月和1998年10月美國FDA分別通過了用于臨床腫瘤治療的兩個單抗—Ritμximab(ritμxan)和Trastμzμmab(herceptin)[Dillman R O.Magic bμllets at last！Finally—approval of a monoclonal antibody for the treatment of cancer[J].Cancer Biother Radiopharm，1997，12:223－225.]。目前認為單抗的作用機制有阻斷作用、信號傳導作用以及靶向作用等三種作用機制，沒有直接的殺傷作用。另外還存在藥理學方面的問題，主要是到達腫瘤的藥量不足。由于偶聯物是異體蛋白，會被網狀內皮系統攝取，有相當數量將積聚于肝、脾和骨髓。偶聯物是大分子物質，通過毛細血管內皮層及穿透腫瘤細胞外間隙均受到限制。1.3腫瘤的過繼免疫治療腫瘤的過繼免疫治療是指將體外激活的自體或異體免疫效應細胞輸注給患者，以殺傷患者體內的腫瘤細胞。腫瘤過繼性免疫治療中的一個關鍵問題是尋找合適的腫瘤殺傷細胞。自上世紀80年代以來，包括LAK、細胞因誘導的殺傷細胞(cytokine-indμced killers，CIK)、TIL等細胞已先后應用于臨床，但由于存在著擴增倍速較低、細胞來源困難、細胞毒力不高等諸多問題，在臨床應用上受到限制。如何提高T細胞的腫瘤抗原特異性具有重要的臨床意義。T細胞對腫瘤抗原的識別主要是通過T細胞受體(T cell receptor，TCR)識別腫瘤細胞表面的人類白細胞抗原(hμman leμkocyte antigen，HLA)-肽復合物，因此，T細胞對腫瘤抗原識別的特異性取決于T細胞表面的TCR。利用分子生物學的手段克隆腫瘤特異性T細胞的TCR，并通過構建含TCR的病毒載體，把TCR轉入正常的T細胞中，使這些T細胞因攜帶腫瘤特異性而成為特異性腫瘤殺傷細胞[Johnson L A，Morgan R A，Dμdley M E，et al.Gene therapy with hμman and moμse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissμes expressing cognate antigen[J].Blood，2009，114(3):535－546.]。1.4腫瘤疫苗治療腫瘤疫苗治療是通過給患者體內導入腫瘤抗原來激發患者的特異性抗腫瘤免疫反應。由于疫苗治療具有特異性、在體內免疫效應維持時間長等優點，目前已成為研究熱點。近年來多肽疫苗、核酸疫苗、全蛋白疫苗、抗獨特性抗體疫苗、重組病毒疫苗、細菌疫苗、基因修飾的腫瘤細胞疫苗、樹突狀細胞(dendritic cells，DC)疫苗等得到廣泛研究和應用[Robbins P F，Morgan R A，Feldman S A，et al.Tμmor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanomaμsing genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ESO-1[J].J Clin Oncol，2011，29(7):917－924.]。腫瘤疫苗治療的大規模應用還有三個方面的問題亟待解決。首先，腫瘤相關抗原，每個腫瘤、每個亞型、每個腫瘤分期，這些相對抗原表達是不一樣的，所以選準抗原，選準病人人群是致關重要的。第二，如何達到腫瘤抗原在樹突狀細胞中髙效吸收與表達？抗原被樹突狀細胞吸收是以表面受體為介導的。樹突狀細胞有十幾個受體，如何根據特定的抗原選擇相應的受體？第三，針對樹突狀細胞分化成熟的調控。樹突狀細胞的分化成熟是一個非常復雜的過程，它既可走向激活T細胞也可以走向抑制T細胞。[靶向DC細胞的治療型腫瘤疫苗：亮點與挑戰并存。http://www.biodiscover.com/news/research/115794.html]。1.5腫瘤CAR-T治療CAR-T，全稱是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immμnotherapy，嵌合抗原受體T細胞免疫療法，結構如圖1所示[Eleanor J.Cheadle,et al.CAR T cells:driving the road from the laboratory to the clinic.Immμnological Reviews 2014.Vol.257:91–106]。第一代CAR介導的T細胞激活是通過CD3z鏈或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。CD3z鏈能夠提供T細胞激活、裂解靶細胞、調節IL-2分泌以及體內發揮抗腫瘤活性所需的信號。但第一代CAR本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種靶向CD30的復制缺陷性重組慢病毒的CAR?T轉基因載體，其特征在于，包括：用于質粒復制的原核復制子pUC?Ori序列，如SEQ?ID?NO.2所示；用于目的菌株大量擴增的含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQ?ID?NO.1所示；用于增強真核細胞內的復制的病毒復制子SV40?Ori序列，如SEQ?ID?NO.3所示；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；用于真核細胞表達綠色熒光的ZsGreen1綠色熒光蛋白，如SEQ?ID?NO.11所示；用于共同轉錄表達蛋白質的IRES核糖體結合序列，如SEQ?ID?NO.12所示；用于嵌合抗原受體基因的真核轉錄的人EF1α啟動子，如SEQ?ID?NO.14所示；用于增強轉基因的表達效率的eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件，如SEQ?ID?NO.13所示；以及用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體；所述用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR的嵌合抗原受體包括：如SEQ?ID?NO.15所示的CD8?leader嵌合受體信號肽、如SEQ?ID?NO.20所示的CD30單鏈抗體輕鏈VL、如SEQ?ID?NO.19所示的Optimal?Linker?C、如SEQ?ID?NO.16所示的CD30單鏈抗體重鏈VH、如SEQ?ID?NO.21所示的CD8?Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ?ID?NO.22所示的CD8?Transmembrane嵌合受體跨膜區、CD28、如SEQ?ID?NO.23所示的CD137嵌合受體共刺激因子、如SEQ?ID?NO.24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域；所述用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的三代CAR的嵌合抗原受體包括：如SEQ?ID?NO.15所示的CD8?leader嵌合受體信號肽、如SEQ?ID?NO.20所示的CD30單鏈抗體輕鏈VL、如SEQ?ID?NO.19所示的Optimal?Linker?C、如SEQ?ID?NO.16所示的CD30單鏈抗體重鏈VH、如SEQ?ID?NO.21所示的CD8?Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ?ID?NO.22所示的CD8?Transmembrane嵌合受體跨膜區、CD28、如SEQ?ID?NO.23所示的CD137嵌合受體共刺激因子、如SEQ?ID?NO.24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域、以及如SEQ?ID?NO.25所示的CD28嵌合受體共刺激因子。...

【技術特征摘要】
1.一種靶向CD30的復制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉基因載體，其特征在于，包括：用于質粒復制的原核復制子pUC Ori序列，如SEQ ID NO.2所示；用于目的菌株大量擴增的含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQ ID NO.1所示；用于增強真核細胞內的復制的病毒復制子SV40 Ori序列，如SEQ ID NO.3所示；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；用于真核細胞表達綠色熒光的ZsGreen1綠色熒光蛋白，如SEQ ID NO.11所示；用于共同轉錄表達蛋白質的IRES核糖體結合序列，如SEQ ID NO.12所示；用于嵌合抗原受體基因的真核轉錄的人EF1α啟動子，如SEQ ID NO.14所示；用于增強轉基因的表達效率的eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件，如SEQ ID NO.13所示；以及用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體；所述用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR的嵌合抗原受體包括：如SEQ ID NO.15所示的CD8 leader嵌合受體信號肽、如SEQ ID NO.20所示的CD30單鏈抗體輕鏈VL、如SEQ ID NO.19所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO.16所示的CD30單鏈抗體重鏈VH、如SEQ ID NO.21所示的CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ ID NO.22所示的CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區、CD28、如SEQ ID NO.23所示的CD137嵌合受體共刺激因子、如SEQ ID NO.24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域；所述用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的三代CAR的嵌合抗原受體包括：如SEQ ID NO.15所示的CD8 leader嵌合受體信號肽、如SEQ ID NO.20所示的CD30單鏈抗體輕鏈VL、如SEQ ID NO.19所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO.16所示的CD30單鏈抗體重鏈VH、如SEQ ID NO.21所示的CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ ID NO.22所示的CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區、CD28、如SEQ ID NO.23所示的CD137嵌合受體共刺激因子、如SEQ ID NO.24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域、以及如SEQ ID NO.25所示的CD28嵌合受體共刺激因子。2.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括：如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag順式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE順式元件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT順式元件。3.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述慢病毒包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括：如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag順式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE順式元件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT順式元件所述慢病毒包裝順式元件，以及如SEQ ID NO.4所示的RSV啟動子。4.如權利要求1-3任一項所述的載體，其特征在于，所述eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件有6個核苷酸的增強突變，具體為：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。5.一種如權利要求1所述的靶向CD30的復制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉基因載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)將含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列(如SEQ ID NO.1所示)、原核復制子pUC Ori序列(如SEQ ID NO.2所示)、病毒復制子SV40 Ori序列(如SEQ ID ...

【專利技術屬性】
技術研發人員：祁偉，俞磊，歐黃思，
申請(專利權)人：上海優卡迪生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31