本發(fā)明專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體來講涉及一種以海洋細(xì)菌為來源編碼獲取Κ?卡拉膠酶基因的及重組酶制備方法。本發(fā)明專利技術(shù)包括如下步驟：一、PCR法獲得海洋細(xì)菌中κ?卡拉膠酶基因的全長序列；二、以海洋細(xì)菌為來源基因κ?卡拉膠酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株的構(gòu)建；三、利用重組表達(dá)菌株表達(dá)重組κ?卡拉膠酶；四、重組酶的活性檢測。本發(fā)明專利技術(shù)通過一種新的、高效、準(zhǔn)確的途徑，以海洋細(xì)菌為來源獲得的κ?卡拉膠酶基因應(yīng)用于大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建，并實現(xiàn)具有活性重組酶的異源表達(dá)，為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)卡拉膠酶提供基礎(chǔ)；通過本發(fā)明專利技術(shù)中的以海洋細(xì)菌為來源獲得的κ?卡拉膠酶基因，與已知κ?卡拉膠酶序列相似性最高為44％。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
：本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體來講涉及一種以海洋細(xì)菌為來源編碼獲取Κ-卡拉膠酶基因的及重組酶制備方法。
技術(shù)介紹
：卡拉膠酶(Carrageenase)是一種海藻多糖水解酶，可降解卡拉膠的β-1,4糖苷鍵，生成系列偶數(shù)的卡拉膠寡糖。根據(jù)識別底物特異性，可將卡拉膠降解酶分為以下三種：κ-卡拉膠酶(EC 3.2.1.83)、ι-卡拉膠酶(EC 3.2.1.157)和λ-卡拉膠酶(EC 3.2.1.162)。κ-卡拉膠酶(κ-Carrageenase)屬于糖苷水解酶GH16家族，該家族成員還包括昆布多糖酶、β-瓊膠酶、內(nèi)切β-1,3-1,4-葡聚糖酶、內(nèi)切β-牛乳糖苷酶和木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶等，它們有共同的保守核心催化區(qū)域E[ILV]D[IVAF][VILMF(0,1)]E序列。ι-卡拉膠酶(ι-Carrageenase)屬于糖苷水解酶GH 82家族。具有DFGX3DGX6AX3A的糖苷酶保守區(qū)域。λ-卡拉膠酶(λ-Carrageenase)既不屬于κ-卡拉膠酶的GH16，也不屬于ι-卡拉膠酶的GH82，是一類新型的糖苷水解酶家族。卡拉膠酶主要來源海洋微生物，也有部分來源海洋軟體動物。已在假單胞菌屬(Pseudomonas)、別單胞菌屬(Alteromonas)、噬纖維菌屬(Cellulophaga)、弧菌屬(Vibrio)、黃桿菌屬(Flavobacteriales)、浮霉菌屬(Planctomycetales)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、紫紅球菌目(Puniceicoccales)等微生物中發(fā)現(xiàn)了不同類型卡拉膠酶。卡拉膠酶在這些微生物體內(nèi)的存在方式具有多樣性。例如λ-卡拉膠酶僅存在某些特定的微生物，有些微生物體內(nèi)同時具有多種類型的卡拉膠降解酶，例如Pseudoalteromonas carrageenovora能同時分泌κ-、λ-和ι-卡拉膠酶，而Alteromonas carrageenovora和Zobellia galactanovorans能同時分泌κ-和ι-卡拉膠降解酶。目前關(guān)于卡拉膠酶的研究主要包括生化方面和分子生物學(xué)方面。前者主要集中在卡拉膠酶高產(chǎn)菌株的選育、發(fā)酵劑產(chǎn)酶條件的優(yōu)化、酶學(xué)性質(zhì)研究、降解機(jī)制及產(chǎn)物鑒定；后者主要集中編碼卡拉膠酶基因的克隆、序列分析、重組表達(dá)、酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究等。雖然大量卡拉膠酶高產(chǎn)菌株被發(fā)現(xiàn)，并對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件和酶學(xué)特性進(jìn)行了大量研究，但目前卡拉膠酶無法滿足規(guī)模化酶解法制備卡拉膠寡糖的需求。酶解法制備卡拉膠寡糖研究領(lǐng)域中存在：產(chǎn)酶量和酶活力普遍較低，無法達(dá)到規(guī)模化生產(chǎn)的要求；野生菌株培養(yǎng)體系復(fù)雜，海洋來源需要大量的NaCl，為后續(xù)卡拉膠寡糖的純化增加產(chǎn)本產(chǎn)酶條件不穩(wěn)定；容易出現(xiàn)菌種退化，無法連續(xù)生產(chǎn)等問題。采用分子生物學(xué)技術(shù)從編碼卡拉膠酶的功能基因入手，通過基因
克隆、序列分析、重組表達(dá)、表達(dá)特性及構(gòu)效關(guān)系方面的研究是解決上述困難的有效方法之一，而獲得優(yōu)良的編碼卡拉膠酶的基因是進(jìn)行上述工作的基礎(chǔ)。現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)多數(shù)還是采用文庫構(gòu)建等傳統(tǒng)方法獲取卡拉膠酶基因，但文庫構(gòu)建工作費時費力，需要通過大量篩選獲得陽性克隆，進(jìn)而通過亞克隆等環(huán)節(jié)才能獲得完整基因。伴隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，海量基因組被解析并釋放基因組數(shù)據(jù)，如何借助這些基因組數(shù)據(jù)服務(wù)于卡拉膠酶基因的挖掘是亟待解決的問題。如果有一種方法能在比較基因組學(xué)分析的基礎(chǔ)上，借助于傳統(tǒng)同源克隆的原理而從基因組中通過一次PCR方法獲得完整目的基因，則可以免除上述文庫構(gòu)建的繁瑣工作，從而實現(xiàn)目的基因的高效獲得。
技術(shù)實現(xiàn)思路
：本專利技術(shù)的目的⑴是提供一種從產(chǎn)卡拉膠酶的菌株中通過一次PCR方法直接獲得完整目的基因的方法，建立了一種新的、高效、準(zhǔn)確的途徑，并將獲得的κ-卡拉膠酶基因應(yīng)用于大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建，并實現(xiàn)具有活性重組酶的異源表達(dá)，為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)卡拉膠酶提供基礎(chǔ)。本專利技術(shù)的目的⑵是利用該方法克隆獲得一個全新海洋細(xì)菌來源κ-卡拉膠酶基因。本專利技術(shù)的目的⑶是利用限制性內(nèi)切酶，將克隆獲得的卡拉膠酶基因連接到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建卡拉膠酶基因的表達(dá)載體pET-28a(+)-Cly-κ-car，通過轉(zhuǎn)化技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌(BL21)，構(gòu)建工程菌株，最終獲得能產(chǎn)活性重組卡拉膠酶的BL21-Cly-κ-CAR工程菌株。本專利技術(shù)的技術(shù)方案包括如下步驟：一、PCR法獲得海洋細(xì)菌C.lytica M9中κ-卡拉膠酶基因的全長序列⑴根據(jù)海洋細(xì)菌C.lytica M9(菌種保藏號：CGMCC No：10829)中16s RNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，找到與目的菌株最相近且具有全基因組數(shù)據(jù)的參考菌株(Cellulophaga lytica DSM 7489,基因組數(shù)據(jù)信息NC_015167)；⑵根據(jù)基因組注釋信息和NCBI中blast程序驗證之后，找到參考菌株(C.lytica DSM7489)基因組中編碼κ-卡拉膠酶的基因Celly_2915編號(gi|325284916:3333332-3334777蛋白序列ADY30732)，同時確定該參考菌株中編碼κ-卡拉膠酶的相鄰上游基因Celly_2914編號(gi|325284916:3332347-3333021蛋白序列ADY30731)和下游基因Celly_2916編號(gi|325284916:3335359-3336312蛋白序列ADY30733)及分別對應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列；⑶根據(jù)相鄰上下游基因(Celly_2914和Celly_2916)的氨基酸序列通過BlocκMaκer在線軟件程序進(jìn)行比對和尋找保守核心區(qū)域，其中，Celly_2914的核心保守序列為：QGSINPM和Celly_2916的核心保守序列為：SGLGEPNE；⑷根據(jù)Celly_2914基因的核心保守序列采用CODEHOP軟件設(shè)計正向引物，正向引物為：TCTTGCTTCGCTACCAGCTC；根據(jù)根據(jù)Celly_2916基因的核心保守序列采用CODEHOP軟件設(shè)計反向引物，反向引物為：TTTGGCTCTCCCAAACCAGA；⑸以目的菌株C.lytica M9基因組為模板，利用步驟⑷中所述的引物經(jīng)一步PCR方法獲得一種全新的海洋細(xì)菌為來源，含有編碼完整κ-卡拉膠酶基因的原始編碼序列，其核苷酸序列為Seq ID.NO.1，該基因DNA序列全長1488bp，編碼495個氨基酸，含有45個氨基酸的信號肽序列。κ-卡拉膠酶的氨基酸序列為Seq ID.NO.2，該酶屬于糖苷水解酶GH16家族。二、海洋細(xì)菌C.lytica M9來源基因κ-卡拉膠酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株的構(gòu)建將上一步驟獲得的κ-卡拉膠酶基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。首先基于獲得的κ-卡拉膠酶基因的全長序列(采用軟件預(yù)測ORF中的信號肽區(qū)域)，設(shè)計獲取目的基因成熟肽部分的上下游引物：上游引物Cly-κ-Car-F：CCCGAATTCCAAACATCTAATCCGAATGATAATT下游引物Cly-κ-Car-R：GGCTCGAGCTATTGAATAAGCAGTTGTTTTG；采用含有原始編碼序列的質(zhì)粒pMD-18T-原始編碼序列模板，通過PCR方法獲得本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種以海洋細(xì)菌為來源獲取的κ?卡拉膠酶基因，其特征在于，其核苷酸序列為Seq?ID.NO.1，該基因DNA序列全長1488bp，編碼495個氨基酸，含有45個氨基酸的信號肽序列。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種以海洋細(xì)菌為來源獲取的κ-卡拉膠酶基因，其特征在于，其核苷酸序列為Seq ID.NO.1，該基因DNA序列全長1488bp，編碼495個氨基酸，含有45個氨基酸的信號肽序列。2.權(quán)利要求1所述的一種以海洋細(xì)菌為來源獲取的κ-卡拉膠酶基因，其特征在于，從海洋細(xì)菌C.lytica M9中獲取的方法包括如下步驟：(1)根據(jù)海洋細(xì)菌C.lytica M9中16s RNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，找到與目的菌株最相近且具有全基因組數(shù)據(jù)的參考菌株；(2)根據(jù)基因組注釋信息和NCBI中blast程序驗證之后，找到參考菌株C.lytica DSM7489基因組中編碼κ-卡拉膠酶的基因Celly_2915編號(gi|325284916:3333332-3334777蛋白序列ADY30732)，同時確定該參考菌株中編碼κ-卡拉膠酶的相鄰上游基因Celly_2914編號(gi|325284916:3332347-3333021蛋白序列ADY30731)和下游基因Celly_2916編號(gi|325284916:3335359-3336312蛋白序列ADY30733)及分別對應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列；(3)根據(jù)相鄰上游基因Celly_2914和下游基因Celly_2916的氨基酸序列，通過BlocκMaκer在線軟件程序進(jìn)行比對和尋找保守核心區(qū)域，其中，Celly_2914的核心保守序列為：QGSINPM和Celly_2916的核心保守序列為：SGLGEPNE；(4)根據(jù)Celly_2914基因的核心保守序列設(shè)計正向引物，正向引物為：TCTTGCTTCGCTACCAGCTC；根據(jù)根據(jù)Celly_2916基因的核心保守序列設(shè)計反向引物，反向引物為：TTTGGCTCTCCCAAACCAGA；(5)PCR擴(kuò)增，以目的菌株C.lytica M9基因組為模板，利用步驟(4)中所述的正反向引物經(jīng)一步PCR方法擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化，獲得含有編碼完整κ-卡拉膠酶基因的原始編碼序列。3.權(quán)利要求1所述的一種以海洋細(xì)菌為來源獲取的κ-卡拉膠酶基因所編碼的κ-卡拉膠酶，其特征在于，κ-卡拉膠酶的氨基酸序列為Seq ID.NO.2，屬于糖苷水解酶GH16家族。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的κ-卡拉膠酶，其特征在于，通過下述步驟制備而成：1)、...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：姚子昂，吳海歌，趙博聞，崔紅利，
申請(專利權(quán))人：大連大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：遼寧;21
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