本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種海洋細(xì)菌新型酯酶以及利用該酯酶手性催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯生產(chǎn)藥物中間體(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯的方法。將該酯酶基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta。由于該酶能在表達(dá)菌株中高度可溶性表達(dá)，并且表現(xiàn)出良好的耐鹽，耐堿，及手性選擇性，因此可以作為工業(yè)化生產(chǎn)抗抑郁藥物中間體(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯的潛在用酶。通過對其反應(yīng)條件的優(yōu)化，可以利用該酶催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯進(jìn)而生產(chǎn)藥物中間體(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯，使其轉(zhuǎn)化率和手性選擇性大大提高。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種海洋細(xì)菌新型酯酶及其制備方法與應(yīng)用。具體的說，涉及海洋細(xì)菌Pelagibacterium halotolerans B2T中酯酶基因pe8及利用該酯酶手型催化3_ (4_氟苯基)戊二酸二甲酯生產(chǎn)藥物中間體(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯的方法。
技術(shù)介紹
光學(xué)純的(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯是一系列重要醫(yī)藥中間體的前體。其中最具代表性的是左旋帕羅西汀鹽酸鹽。它可以使突觸間隙中的5-羥色胺(5-HT)濃度增高，發(fā)揮抗抑郁作用，對其它遞質(zhì)作用較弱，對植物神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的影響較小，作為選擇性中樞神經(jīng)5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑(SSRI)。臨床上被廣泛應(yīng)用于治療抑郁癥，強(qiáng)迫癥，驚恐障礙或社交焦慮障礙等疾病。近年來，抗抑郁藥物帕羅西汀在國內(nèi)外的市場需求與日俱增，其合成方法也在全球備受關(guān)注。因此，探索其簡便，高效經(jīng)濟(jì)的制備方法成為科學(xué)界十分活躍的課題。合成的方法有化學(xué)法和酶法，而酶法由于它的高效、綠色和環(huán)保等優(yōu)點成為研究的首選。Yu 等(TetRahedRon Lett.41 (2000)，5647-5651.)用豬肝臟酯酶選擇性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，得到(S)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯，雖然ee值與產(chǎn)率高達(dá)95%和86%，但是S構(gòu)型的產(chǎn)物并不是合成左旋帕羅西汀正確構(gòu)型前體。Lopez-GaRcia 等(TetRahedRon AsymmetRy.14 (2003), 603-609.)在有機(jī)溶劑中對3- (4-氟苯基)戊二酸二甲酯進(jìn)行氨解反應(yīng)，雖然取得了較高的ee值但產(chǎn)率卻不盡如人意。最近，Liu等(PRocess Biochem.47 (2012)，1037-1041.)利用來自于 CandidaantaRctica的固定化脂肪酶(Novozym435)催化該反應(yīng),得到(R) _3_(4_氟苯基)戍二酸單甲酯，雖然產(chǎn)率和ee值都很高，但是由于商品化酶昂貴的價格，不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。由于海洋微生物酯酶通常具有與其生存環(huán)境相關(guān)的特性，譬如良好的耐鹽性、耐熱性和良好的手性選擇性等，為此我們克隆了海洋細(xì)菌PelagibacteRium halotoleRansB2T中酯酶基因pe8并將其在大腸桿菌Rosetta中高度可溶性表達(dá)。本專利技術(shù)利用該酶催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯進(jìn)而生產(chǎn)藥物中間體(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯。通過對其反應(yīng)條件的優(yōu)化，使其轉(zhuǎn)化率和手性選擇性大大提高。由于該酶能在表達(dá)菌株中高度可溶性表達(dá)，并且表現(xiàn)出良好的耐鹽、耐堿性及手性選擇性，因此可以作為工業(yè)化生產(chǎn)抗抑郁藥物中間體的潛在用酶。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種海洋細(xì)菌新型酯酶、其編碼基因及其制備方法，以及利用該酯酶生產(chǎn)(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯的方法。本專利技術(shù)通過PCR方法，從新型海洋細(xì)菌Pelagibacterium halotolerans B21'中意外克隆到一種新型酯酶PE8。海洋細(xì)菌Pelagibacterium halotolerans B2T系專利技術(shù)人之一許學(xué)偉等從東海海水樣品中分離得到(相關(guān)論文發(fā)表于International Journalof Systematic and Evolutionary Microbiology ;2011 ;61:1817 - 1822),該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心并可提供給公眾使用，保藏編號為CGMCC1.7692τ，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所(100101)，保藏日期為2008年6月。本專利技術(shù)將目前發(fā)表的所有酯酶按照不同的家族進(jìn)行氨基酸多序列比對，找到核心保守序列，然后利用相關(guān)軟件(例如C0DEH0P)尋找可能的兼并引物。依據(jù)引物的基本原則和要求:簡并度盡可能小、Tm值盡可能高、上下游引物之距離盡可能大、上下游引物的TM值盡可能相近等，選擇適宜的兼并引物。經(jīng)過比對，本專利技術(shù)設(shè)計了一對擴(kuò)增酯酶全基因的引物。上游引物為pe8F(5’ -AGGACATATGACCGAACCCGTAAAG-3’，Nde I)，下游引物為 pe8R (5，-CGATAAGCTTCTAGAGGATCTCGCG-3’，HindIII) ο 以論文(International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology ；2011 ；61:1817 - 1822)中報道的菌株 Pelagibacterium halotolerans B2T(CGMCC1.7692T)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，意外獲得一種全新的酯酶pe8基因的全長序列，其特征在于全長660bp (核苷酸序列如Seq ID.NO:1所述)。該基因編碼的酯酶PE8含219個氨基酸(氨基酸序列如Seq ID.NO:2所述)，與已公布的來自于菌株P(guān)arvibaculumlavamentivorans DS-1 的酯酶(YP_001412908)的同源性低至 46%。酯酶ΡΕ8的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析如附圖6所示，表明ΡΕ8和其相似的酯酶屬于familyVI脂類水解酶。在不影響酯酶PE8蛋白活性前提下，可對SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有酯酶PE8活性的衍生蛋白質(zhì)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)的公知常識，蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性是和其功能結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)的。一般來說，只有發(fā)生在功能結(jié)構(gòu)域的位點突變可能對蛋白質(zhì)的二維和三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而影響其生物學(xué)活性。而對于發(fā)生在遠(yuǎn)離功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸位點，由于這一區(qū)域不參與蛋白功能構(gòu)象，因而氨基酸的個別點突變不會對蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性產(chǎn)生實質(zhì)性影響，從而能夠基本保留原蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。優(yōu)選的酯酶PE8突變體具有至少與SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，更優(yōu)選具有至少95%以上的同源性，最優(yōu)選具有至少99%以上的同源性。同理，本專利技術(shù)還保護(hù)對SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列進(jìn)行的替換、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶PE8蛋白生物學(xué)活性的DNA分子。優(yōu)選的酯酶PE8突變體基因具有至少與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90%以上的同源性，更優(yōu)選具有至少95%以上的同源性，最優(yōu)選具有至少99%以上的同源性。利用基因克隆技術(shù)，可將克隆到的酯酶pe8基因連接到合適的載體上，并轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到原核生物或真核生物宿主表達(dá)制備重組酯酶PE8。合適的原核生物宿主包括各種細(xì)菌如E.coli等，合適的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳動物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞)等，優(yōu)選采用原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli。 合適的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種可商業(yè)化購買的原核或真核表達(dá)載體。一個優(yōu)選的例子是將本專利技術(shù)克隆到的酯酶基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET28b(+)上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)出高活性的重組酯酶PE8。所述的酯酶基因pe8的表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株的構(gòu)建，表達(dá)質(zhì)粒為pET28b (+)，轉(zhuǎn)化方法為CaCl2轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化菌株為大腸桿菌DH5 α。所述的利用大腸桿菌Rosetta可溶性表達(dá)ΡΕ8，表達(dá)菌株為大腸桿菌Rosetta (本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種酯酶PE8蛋白，是具有如下（1）或（2）特征的蛋白質(zhì)：?（1）、其氨基酸序列與Seq?ID?NO.2所示序列一致；?（2）、將Seq?ID?NO.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加且具有酯酶PE8酶活性的由（1）衍生的突變體。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種酯酶PE8蛋白，是具有如下(I)或(2)特征的蛋白質(zhì): (1)、其氨基酸序列與SeqID N0.2所示序列一致； (2)、將SeqID N0.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加且具有酯酶PE8酶活性的由(I)衍生的突變體。2.編碼權(quán)利要求1所述的酯酶PE8蛋白的pe8基因，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示；或為對SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列進(jìn)行替換、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶PE8蛋白生物學(xué)活性的pe8突變基因。3.攜帶有權(quán)利要求2所述基因的載體。4.一種宿主，其由權(quán)利要求3所述的載體經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染原核生物或真核生物宿主得到。5.一種利用權(quán)利要求1所述的酯酶PE8生產(chǎn)(R) - 3 - (4 -氟苯基)戊二酸單甲酯的方法，包括以下步驟: (1)、利用酯酶PE8選擇性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯制備(R)- 3 - (4 -氟苯基)戊二酸單甲酯，其反應(yīng)方程式為:6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述的酯酶PE8在反應(yīng)體系中的濃度范圍為 1- ...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳月紅，江夏薇，許學(xué)偉，魏笑蓮，王春生，吳敏，
申請(專利權(quán))人：國家海洋局第二海洋研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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