一種米曲霉阿魏酸酯酶基因(faeA)的克隆及表達(dá)制造技術(shù)

一種米曲霉阿魏酸酯酶基因(faeA)的克隆及表達(dá)。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提出了一種源于Aspergillus?oryzae?CICC?40186的新型A類(lèi)阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達(dá)的方法，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1，相應(yīng)的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2，相應(yīng)的基因命名為Aor?faeA。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)了產(chǎn)阿魏酸酯酶工程菌的構(gòu)建以及重組阿魏酸酯酶的高效表達(dá)的方法，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及來(lái)源于米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的一種新型A 型阿魏酸酯酶(faeA)基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達(dá)，屬于生物工程

技術(shù)介紹
阿魏酸(ferulic acid)是肉桂酸的一種，化學(xué)名是(3-甲基_4_輕基)_3_苯基-2-丙烯酸，或者3-甲基-4-羥基肉桂酸，是植物界普遍存在的一種酚酸，其在植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中起著重要的作用，可以在植物細(xì)胞壁的木質(zhì)素與木質(zhì)素之間、木質(zhì)素與半纖維素之間、半纖維素與半纖維素之間形成交接，從而構(gòu)成一個(gè)骨架結(jié)構(gòu)，使得整個(gè)細(xì)胞壁變得堅(jiān)硬。在谷物的細(xì)胞壁中，阿魏酸的單體和多種二聚體主要以酯鍵的形式連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上。阿魏酸主要的生理功能有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病，并具有抗菌消炎以及抗突變和防癌作用。反式阿魏酸在美國(guó)、日本已允許用作食品添加劑，目前在醫(yī)藥、食品和化妝品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。阿魏酸酯酶(EC. 3. I. I. 73)又稱(chēng)肉桂酸酯酶、肉桂酰酯酶，是羧酸水解酶的一個(gè)亞類(lèi)，也是一種胞外水解酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚阿魏酸酯和多聚阿魏酸酯中的酯鍵， 一方面促進(jìn)半纖維素、木素與纖維素的分離，有利于纖維素的進(jìn)一步利用；另一方面促進(jìn)阿魏酸等酚酸類(lèi)物質(zhì)的分離。阿魏酸酯酶在生物乙醇生產(chǎn)、制漿造紙、動(dòng)物飼料生產(chǎn)和生物合成中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。目前對(duì)于阿魏酸酯酶的研究，主要集中于對(duì)原始菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化以增加產(chǎn)酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)來(lái)提高阿魏酸酯酶的酶活。近年來(lái)，隨著對(duì)自然界半纖維素資源的開(kāi)發(fā)利用，尤其是反式阿魏酸優(yōu)越的生理功能，人們對(duì)不同來(lái)源和不同特性的阿魏酸酯酶進(jìn)行了深入地研究，阿魏酸酯酶的應(yīng)用領(lǐng)域得到了不斷地拓展，除了在食品方面的利用，其在造紙、飼料、紡織、釀酒、醫(yī)藥、環(huán)境和能源等工業(yè)領(lǐng)域逐步開(kāi)始了廣泛的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的是提供一種源于Aspergillus oryzae CICC 40186的新型A類(lèi)阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達(dá)的方法，為該阿魏酸酯酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。根據(jù)氨基酸序列以及底物特異性等，將阿魏酸酯酶分為A、B、C、D四類(lèi)，Shin等研究表明這四類(lèi)阿魏酸酯酶都含有不同的保守序列和基序。根據(jù)同源比對(duì)，Aspergillus oryzae CICC 40186分泌的為A型阿魏酸酯酶，命名為Aor FaeA，其相應(yīng)的基因命名為Aor faeA。A. oryzae菌株購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(China Center of Industrial CultureCollection，CICC)，編號(hào)為 40186。本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案一種源自A. oryzae CICC 40186的新型的A類(lèi)阿魏酸酯酶 (Aor FaeA)，其基因(Aor faeA)成熟肽cDNA核苷酸序列為SEQ ID NO 10所述的由成熟肽cDNA序列所推導(dǎo)的Aor FaeA氨基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的重組阿魏酸酯酶的活性測(cè)定方法以對(duì)硝基苯酚阿魏酸酯(pNPF)作為反應(yīng)底物，反應(yīng)體系為200 μ L，緩沖體系為25mmol/LpH6. 4的磷酸緩沖液(含2. 5% Tritonx-100)，對(duì)硝基苯酚阿魏酸酯(溶于DMS0)終濃度為O. 6mmol/L，加入100 μ L的酶，測(cè)定產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚在410nm處吸光度。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照(100 μ L粗酶液于沸水浴中滅、酶3min，其他操作步驟同上)。醋酶活力定義在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化底物水解生成IymoL對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為一個(gè)活力單位(U)。所述的Aor faeA成熟肽cDNA序列的克隆和表達(dá)的方法如下(I)從已報(bào)道的Aspergillus oryzae RIB 40基因組信息中找出編碼米曲霉A類(lèi)阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后對(duì)該序列進(jìn)行開(kāi)放讀碼框分析和信號(hào)肽預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物序列如下FAE-F :5，GAATTCGCAATCACTCAGGGGATCT 3，F(xiàn)AE-R :5’ GCGGCCGCCTACCATGTACAGGCTCCG 3’提取A.oryzae CICC 40186 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. O)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。將兩輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T載體連接(pUCm-T-faeA)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到AorfaeA成熟肽cDNA序列。(2)將測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-faeA與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-faeA(圖I)，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。(3)GS115/faeA的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用Sac I對(duì)pPIC9K_faeA進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/faeA;按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用紫外吸收法測(cè)定重組阿魏酸酯酶活性。本專(zhuān)利技術(shù)的有益效果本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種來(lái)源于A. oryzae CICC 40186的新型的阿魏酸酯酶成熟肽基因cDNA序列的克隆及表達(dá)的方法，生物信息學(xué)分析表明該阿魏酸酯酶屬于此類(lèi)酶的A類(lèi)，所以命名為Aor FaeA，其相應(yīng)的基因命名為Aor faeA。本專(zhuān)利技術(shù)為該酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為其他菌株新型阿魏酸酯酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖I :重組質(zhì)粒pPIC9K_faeA的構(gòu)建示意圖具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本專(zhuān)利技術(shù)的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本專(zhuān)利技術(shù)，而不用于限制本專(zhuān)利技術(shù)的范圍。實(shí)施例1A. oryzae CICC 40186 faeA成熟肽cDNA序列的克隆以A.oryzae CICC 40186 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4和FAE-F為引物進(jìn)行第一輪PCR，其反應(yīng)條件為940C 5min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s，51。。30s, 72°C lmin)，72°C IOmin ;以 FAE-F 和 FAE-R 為引物進(jìn)行第二輪 PCR，其反應(yīng)條件為94°C 5min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s,54°C 30s, 72°C lmin)， 72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接 (pUCm-T-Aor faeA)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序。實(shí)施例2Aor faeA成熟肽基因在畢赤酵母GSl 15中的表達(dá)將測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-faeA與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切， 回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-faeA，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。用Sac I對(duì)pPIC9K_faeA進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種來(lái)源于Aspergillus?oryzae?CICC?40186的新型A類(lèi)阿魏酸酯酶，其核苷酸和氨基酸序列分別為SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種來(lái)源于Aspergillus oryzae CICC 40186的新型A類(lèi)阿魏酸酯酶,其核苷酸和氨基酸序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。2.A. oryzae CICC 40186新型A類(lèi)阿魏酸酯酶基因序列克隆及表達(dá)的方法 (1)從已報(bào)道的Aspergillusoryzae RIB 40基因組信息中找出編碼黑曲霉A類(lèi)阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后對(duì)該序列進(jìn)行開(kāi)放讀碼框分析和信號(hào)肽預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物序列如下FAE-F :5，GAATTCGCAATCACTCAGGGGATCT 3，F(xiàn)AE-R :5’ GCGGCCGCCTACCATGTACAGGCTCCG 3’提取 A. oryzae CICC 40186 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄔敏辰，曾妍，龔燕燕，李劍芳，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：江南大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：