一種編碼延胡索酸還原酶的基因?frd1A，具有下列核苷酸序列之一：1）序列表No.1的DNA序列；2）序列表No.２的氨基酸殘基的序列。序列表中序列1的DNA從5’端第1個核苷酸開始起始密碼子ATG到444個堿基以終止密碼子TAG結束，存在一個完整的ORF，自5’端的第1-3位核苷酸為frd1A基因的起始密碼子ATG，自5’端的第442-444位核苷酸為frd1A基因的終止密碼子TAG。本發明專利技術所提供的延胡索酸還原酶及其編碼酶的基因對研發新的生物工藝生產琥珀酸具有重要的意義和廣泛的用途。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種延胡索酸還原酶及其編碼酶的基因與應用。
技術介紹
琥珀酸，又名丁二酸，是一種具有重要應用價值的生物基平臺化合物，能夠作為化學原材料被廣泛應用于合成藥品及生物可降解性聚合物。目前主要利用化學合成法生產琥珀酸，然而，傳統上的化學法成本高，易造成環境污染，限制了琥珀酸作為基本化工原料的廣泛應用。因此，以微生物發酵法生產琥珀酸的研究與開發顯得越來越重要。而作為微生物法生產琥珀酸的關鍵酶一延胡索酸還原酶，對其研究也就受到廣泛的重視。延胡索酸還原酶(fumarate reductase, Frd, EC L 3.1. 6),主要催化延胡索酸還原為琥珀酸，是很多生物厭氧呼吸的關鍵酶，延胡索酸作為最終電子受體。革蘭氏陰性菌及多數兼性厭氧革蘭氏陽性菌，都具有這種特性。并且在一些綠藻、原生動物、寄生蠕蟲和低等海洋生物等真核生物的新陳代謝過程中，具有重要作用。該酶催化的延胡索酸還原反應和琥珀酸脫氫酶催化的琥珀酸氧化反應互為逆反應，后者主要存在于有氧呼吸中，是TCA(三羧酸循環)循環中的關鍵酶之一。對于延胡索酸還原酶，目前在模式生物大腸桿菌中的研究比較透徹。這種結構的酶含有3到4個亞單位A、B、C、D。其中親水性的Frd-A和Frd-B亞基形成酶催化域，I到2個小的疏水亞基形成膜錨定結構。從大腸桿菌中分離得到的延胡索酸還原酶是一種醌醇類膜結合型蛋白，具有4個亞基，并與Frd輔基共價結合。與琥珀酸脫氫酶(SDH)即復合體11具有較高的同源性。但是兩酶的表達條件有所不同，Frd是在缺氧條件下表達，而SDH則是在有氧條件下表達。Frd由frd(AB⑶)操縱子編碼，表達4個不同的多肽。其中frdA基因編碼66kDa的FAD亞基復合體，而frdB基因則編碼27kDa的鐵硫簇亞基復合體，這兩個亞基組成大腸桿菌的催化域，并通過frd⑶編碼的Frd-C和Frd-D亞基結合于大腸桿菌內膜上。目前已發現延胡索酸還原酶主要可分為兩類膜結合型和可溶型。大多數的延胡索酸還原酶屬于膜結合型，含有3-4個亞基，即一個催化亞基，一個鐵簇蛋白亞基，以及1-2個將催化亞基和鐵簇蛋白亞基結合于膜上的錨定亞基。催化亞基含有活性位點，而鐵簇蛋白亞基則通過錨定亞基將電子傳遞給催化亞基。此類型的延胡索酸還原酶主要是在厭氧條件以及維持氧還平衡時才起還原延胡索酸生成琥珀酸的功能。而第二種類型的延胡索酸還原酶是可溶型的獨立酶，與膜結合型酶的催化亞基具有同源性。目前已知的具有此種類型酶的生物還很少。不同微生物中延胡索酸還原酶的產生條件及所需輔酶都有所不同，或以NADH為輔酶，或以FAD為輔酶；輔酶與酶蛋白的結合方式也有差別，可共價結合，也可非共價結合;而在酶反應過程中，電子傳遞中的供受體也有區別，有以泛醌，也有以甲基萘醌。當今有關延胡索酸還原酶的研究，均是直接從菌體分離獲得，之后再進行酶的特性研究，是所研究微生物自身含有的基因。諸如Cesar Luna-Chavez等人從厭氧培養的大腸桿菌膜碎片中提取到延胡索酸還原酶粗酶液，然后通過離子交換柱、灌柱、過濾等方法純化酶，得到了高活性的純酶液，最后利用非離子去污劑得到了棕黑色的延胡索酸還原酶結晶。但該酶并非微生物正常代謝過程中的必須酶，只有在外界條件改變時才會產生，因此在實際生產時，對外界條件有很高的要求，不利于大規模的生產應用。研究來自于未培養微生物、編碼延胡索酸還原酶新基因，不僅可以研發新的生物生產工藝提高琥珀酸產量，也可以為構建高產琥珀酸的基因工程菌提供新的理論參考模式和依據。目前國內外還鮮見有關未培養微生物延胡索酸還原酶新基因的研究。因此，利用宏基因組學技術，研究極端環境體系未培養微生物和克隆未培養微生物酶基因，分離篩選新型延胡索酸還原酶基因，在理論上及在實際應用中都具有特別重要的研究意義
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種編碼延胡索酸還原酶的基因及其應用，通過構建來自于廣西北部灣海洋環境沉積物宏基因組文庫，采用酶的直接測序篩選策略，從基因文庫里面分離得到了編碼延胡索酸還原酶的新基因，可在宿主細胞中大量表達該基因以生產琥珀酸，對于研發新的生物工藝大量生產琥珀酸具有重要的意義和廣泛的用途。本專利技術所提供的一種編碼延胡索酸還原酶的基因，名稱為frdlA，來源于廣西北部灣海洋環境體系未培養微生物，具有下列核苷酸序列之一I) 一種編碼延胡索酸還原酶的基因frdlA，其核苷酸序列為序列表No.1所示。2)所述基因編碼的蛋白質，其氣基酸序列如序列表No. 2所不。序列表No. 2所示的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有延胡索酸還原酶活性的蛋白質。攜帶該基因的質粒大腸埃希氏菌Escherichia coli已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC No. 5936，保存日期為2012年3月27日，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號。序列表No.1的DNA是克隆重組質粒pGXAR313所含的外源DNA片段中攜帶的完整開放閱讀框架(ORF，Open Reading Frame)，該ORF由444個堿基組成，GC含量為49. 67%。為一個可能完整的新型延胡索酸還原酶基因，新基因被命名為frdlA。從5’端第I個核苷酸開始起始密碼子ATG到444個堿基以終止密碼子TAG結束，為一個完整的0RF，自5’端的第1-3位核苷酸為frdlA基因的起始密碼子ATG，自5’端的第442-444位核苷酸為frdlA基因的終止密碼子TAG。該ORF—共444個核苷酸可編碼由147個氨基酸組成的蛋白。通過Blastx分析該氨基酸序列和來自于菌株“Runella slithyformis DSM 19594”的一個“Succinate dehydrogenase/fumarate reductase iron-sulfur subunit，，基因存在 82%的相似性，69 %的一致性。本專利技術提供的一種編碼延胡索酸還原酶的基因的克隆方法包括下列步驟( I)從廣西北部灣海洋環境樣品中提取未培養微生物宏基因組DNA，構建海洋環境宏基因組文庫；(2)基于序列特異性的篩選策略，從海洋環境宏基因組文庫中分離含有延胡索酸還原酶的克隆。本專利技術提供的編碼延胡索酸還原酶的新基因，可在宿主細胞中大量表達該基因以生產延胡索酸還原酶，從而構建新的生物工藝進行琥珀酸的生產，在構建新的生物工藝生產琥珀酸等方面具有廣泛的用途。附圖說明圖1為從廣西北部灣海洋環境樣品中提取的未培養微生物的宏基因組DNA。圖2為廣西北部灣海洋環境宏基因文庫克隆的限制性內切酶EcoRI酶切分析以判斷文庫質量。圖3為原始克隆PGXAR313的酶切檢測結果。圖4為frdlA基因DNA序列以及編碼產物分析圖。圖5為重組表達克隆E. coli Tuner (DE3)pLacI/pGXAR313G的構建檢測分析。 圖6為攜帶frdlA基因的重組質粒pGXAR313G的DNA轉化大腸桿菌E. coliTuner(DE3)pLacI后得到的重組表達克隆的蛋白的SDS-PAGE分析結果。圖7為延胡索酸在FrdlA重組蛋白作用下的產物分析結果。圖8為不同溫度對FrdlA重組蛋白的酶活影響。圖9為不同pH值對FrdlA重組蛋白的酶活影響。具體實施例本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種編碼延胡索酸還原酶的基因frd1A，其特征在于，其核苷酸序列為序列表No.1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔣承建，吳蘭蘭，唐咸來，申佩弘，武波，
申請(專利權)人：廣西大學，
類型：發明
國別省市：
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