一種百合ANS基因克隆方法，提取以及純化百合花瓣RNA，合成cDNA第一鏈，應用一對引物通過聚合酶鏈式反應對百合cDNA第一鏈進行擴增，應用3′RACE引物對聚合酶鏈式反應產物進行3′RACE克隆，應用5′RACE引物對聚合酶鏈式反應產物進行5′RACE克隆，用Seqman軟件將所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列進行拼接，得到A基因的cDNA全長序列，共1356個堿基，PCR擴增反應后進行切膠回收、連接轉化、藍白斑篩選、菌落PCR。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及ー種基因及其克隆方法，尤其是百合ANS基因及其克隆方法。
技術介紹
花色是花卉最重要的性狀之一，它主要由類黃酮、類胡蘿卜素、生物堿三大類色素決定。類黃酮是大多數花色形成的決定性色素群，它存在于花瓣表皮細胞液中，其中花青素屬紅色系，其他均屬黃色系；類胡蘿卜素主要呈現黃色、橙色或紅色，它廣泛存在于植物的花、葉、果皮和根等部位；生物堿則參與花瓣黃色、橙色及紅色的形成。這三大類色素的合成都有眾多的結構基因及調控基因參與，包含了多個代謝步驟，作用機理較復雜。傳統的花色育種費時費力，而且有很大的局限，研究花色基因，對于通過分子育種手段來人工修飾改變花卉顔色具有非常重要的意義，如可通過直接導入外源結構基因或調節基因、利用反義技術和共抑制原理等等方法來達到改變花色的目的。另外，由于花色直觀可見，因此它也是研究基因表達調控和基因互作的熱點和基礎方向。目前對屬于類黃酮的花青素的合成代謝和參與其中的基因研究得較為深入，而對類胡蘿卜素等其它色素的研究相對較少。花青素最常見的是矢車菊色素(cyanidin)、飛燕草色素(delphinidin)和天竺葵色素(pelargonidin),它們主要積累在花瓣表皮細胞的液泡中，控制花的紅色、紫羅蘭色及藍色等顏色變化，其含量的增高或降低，都可能改變花的顔色。影響花青素代謝的基因有兩類ー類是不同植物共同具有的結構基因，它們對應的酶有查爾酮合成酶(chalconesynthase, CHS)、查爾酮異構酶(chalcone isomerase, CHI)、黃燒酮 3_ 輕化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)、ニ輕基黃酮醇還原酶(dihydrofIavonol4-reductase, DFR)、花色素苷合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)以及類黃酮 3_0_ 糖基轉移酶(flavonoid3-0_glucosyltransferase, UFGT)等等,它們直接編碼花色素代謝生物合成酶；另ー類是調節基因，目前分為myc轉錄因子和myb轉錄因子兩大類，它們負責控制結構基因表達強度和程式。ANS位于花青素合成通路末端，主要作用是催化無色花色素轉化成有色花色素前體物質丙ニ酰輔酶A和香豆酰輔酶A被CHS和CHI催化形成無色的黃烷酮，黃烷酮在F3H的作用下形成無色的ニ羥基黃酮醇，ニ羥基黃酮醇再被DFR催化還原形成不穩定的無色花色素，然后在ANS和UFGT協同作用下合成各類花色素苷。ANS基因首先是通過轉座子標簽技術從玉米突變體中分離得到的，研究表明ANS和F3 ' H 一祥,屬于2-酮戍ニ酸雙加氧酶家族,類黃酮合成途徑中的黃酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)也屬于此家族,它和ANS具有保守的同源關系。Rosati等從美國金鐘連翅(ForsythiaX intermedia cv. “Spring Glory”)中克隆得到了 ANS 基因和其啟動子，并證明在美國金鐘連翹的花瓣中無花色素苷是由于缺少ANS基因的表達所導致的。目前，已經從眾多花丼中克隆得到了 ANS基因，如郁金香(Tulipa gesneriana)、文心蘭(Oncidium Gower)、大 _菊(Dahlia pinnata ハ瓜葉菊(Senecio cruentus)、茍藥(Paeonialactiflora)等等，但迄今為止，還未見從百合中克隆到該基因的報道。百合(lilium spp.)是百合科百合屬(Lilium)的所有種的總稱,它是世界著名的觀賞花卉之一，有“球根花卉之王”的美譽。英國皇家園藝學會(RHS)和北美百合學會(NALS)按照百合栽培品種和其原始親緣種與雜種的遺傳衍生關系分為9大類，其中的三類亞洲百合雜種(Asiatic hybrids)、磨香百合雜種(Longiflorum hybrids)和東方百合雜種(Oriental hybrids)目前在我國栽培較多。這其中，東方百合系列以其莖桿挺拔、花朵碩大、色彩豐富、芳香宜人的特點備受消費者歡迎，成為市面上主要的百合切花種類。目前對東方百合的研究主要集中在栽培技術、組織培養、采后生理等方面，基因克隆方面的研究較少。本實驗采用同源克隆的方法，設計兼并引物和特異性引物，通過RACE法從東方百合‘Justina’的花蕾中分離得到了 ANS基因的全長序列。這將為進ー步探索百合不同花色的形成原因和分子機制，采用分子育種手段進行百合花色育種奠定基礎。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是通過以下技術方案來實現的 以充分顯色的東方百合‘Justina’花蕾為實驗材料，液氮速凍后置于_80°C超低溫冰箱保存備用，采用Plant RNAzol試劑提取總RNA提取，合成cDNA第一鏈，通過引物ANS-Fl TGGGGRGTSATGCAYATTGTGAACC ANS-Rl TCCTTCGGCGGHTCGCRRAACACWGC對百合ANS基因保守片段的擴增，應用3' RACE引物對聚合酶鏈式反應產物進行3/ RACE克隆，據測序所得的ANS基因保守區序列設計3' RAC外引物和內引物3' GSP ACTATCCCAAATGTCCGCAACC3' NGSP GCTCTACTATGGTGGCAAATGGGTC應用5' RACE引物對聚合酶鏈式反應產物進行5' RACE克隆，據測序所得的ANS基因保守區序列設計5' RAC外引物和內引物5’ GSP GCCAATGTGGACGAGAAGCGAA5’ NGSP CAGGTTGCGGACATTTGGGATAGTAGTT用Seqman軟件將所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列進行拼接，得到A基因的cDNA全長序列，共1356個堿基。找到起始密碼子和終止密碼子的位置，后分別在起始密碼子和終止密碼子處設計引物進行全長驗證。引物序列如下A-forward CCATTCTACTCCCATCAACCA-reverse TATTTCGTAATCCCCCTCTAPCR擴增反應后進行切膠回收、連接轉化、藍白斑篩選、菌落PCR。附圖說明下面結合附圖對本專利技術的具體實施例作進ー步詳細的說明。圖I百合總RNA瓊脂糖電泳結果2百合ANS基因保守區擴增3百合ANS基因3’ RACE片段擴增4百合ANS基因5’ RACE片段擴增5百合ANS基因cDNA全長片段擴增圖具體實施例方式以下將結合附圖，對本專利技術的優選實施例進行詳細的描述；應當理解，優選實施例僅為了說明本專利技術，而不是為了限制本專利技術的保護范圍。以充分顯色的東方百合‘Justina’花蕾為實驗材料，液氮速凍后置于_80°C超低溫冰箱保存備用。I 總 RNA 提取采用Plant RNAzol試劑,具體方法如下I)將花瓣放入研缽中，加入液氮后快速研磨。研磨充分后，按IOOmg組織/mLRNAzol比例加入RNAzol后立即轉入離心管。2)室溫放置lOmin，使花瓣充分裂解。 3)4°C、12000rpm離心5min,吸取上清液到新離心管中。4)按200 L氯仿/mL上清液加入氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置15min，在此過程中不斷溫和上下翻轉離心管，以確保液體混勻。5) 4°C、12000rpm 離心 15min。6)吸取上層本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種百合ANS基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張克中，崔金騰，王瑜，張睿鸝，
申請(專利權)人：北京農學院，
類型：發明
國別省市：
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