定向克隆的方法技術(shù)

本文描述了將插入DNA片段在靶載體中定向克隆的方法。該方法包含將靶載體、插入DNA片段、限制酶和DNA連接酶混合以產(chǎn)生重組DNA分子的步驟。

Directed cloning method

This paper describes a method for directional cloning of inserted DNA fragments in target vectors. The method comprises the steps of mixing target vectors, insertion of DNA fragments, restriction enzymes, and DNA ligase to produce recombinant DNA molecules.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】定向克隆的方法序列表與本申請相關(guān)的序列表以代替紙制副本的文本格式來提供，并且在此以引用的方式并入本說明書中。含有序列表的文本文件的名稱為Sequence_listing_SDS1_0004PCT.txt(序列表SDS1_0004PCT)。該文本文件約為27KB，創(chuàng)建于2014年9月15日。
本專利技術(shù)涉及重組技術(shù)。具體來說，本專利技術(shù)涉及定向克隆的方法。
技術(shù)介紹
分子克隆是一種用來構(gòu)建重組DNA分子的方法。形成重組DNA的組分包括克隆載體、小DNA片段、復(fù)合酶和活細(xì)胞。克隆載體為在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的DNA分子。小DNA片段含有將被克隆的基因。在克隆過程中，使用不同的方法將基因和載體結(jié)合以形成重組DNA分子。然后，將重組DNA分子轉(zhuǎn)化為活細(xì)胞，然后對活細(xì)胞進(jìn)行篩選和復(fù)制。然而，傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)涉及不同條件下的多種方法。因此，需要一種簡單、高效、便宜的將DNA片段分子克隆至靶分子的方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本文描述了將插入DNA片段(insertDNAsegment)定向克隆至載體的方法。不同的實施例包括提供靶載體和插入脫氧核糖核酸(DNA)片段。可以在容器中將靶載體和插入DNA片段與一定量的限制酶和一定量的DNA連接酶混合，以在第一溫度下切割靶細(xì)胞并在第二溫度下將插入DNA片段的至少一部分連接至靶細(xì)胞。在一些實施例中，第一溫度與第二溫度相同或基本相同。在一些實施例中，可以將插入DNA片段連接至靶載體，以產(chǎn)生重組DNA分子，該重組DNA分子包括靶載體的至少一部分和插入DNA片段的至少一部分。在這些例子中，重組DNA為表達(dá)載體。在一些實施例中，插入DNA片段可以包括插入DNA片段的至少一部分和包括限制酶識別位點的DNA序列。在一些實施例中，靶載體可以包括限制酶(例如，II型限制酶)的識別位點。在一些實施例中，當(dāng)混合靶載體、插入DNA片段、一定量的限制酶、一定量的DNA連接酶的時候，容器中的靶載體分子基本上為閉環(huán)質(zhì)粒。在一些實施例中，在單個容器內(nèi)，將靶載體、插入DNA片段、一定量的限制酶和一定量的DNA連接酶混合預(yù)定的時間段。例如，預(yù)定的時間段可以包括從約1分鐘至20分鐘的時間段。在一些實施例中，限制酶可以包括II型限制酶。在這些例子中，II型限制酶可以包括BsaI、BbsI、BsmBI、AarI、Alw26I或LguI的至少一種。在一些實施例中，DNA連接酶可以包括T4DNA連接酶或大腸桿菌DNA連接酶的至少一種。在一些實施例中，插入DNA片段可以包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物。在一些實施例中，第一溫度和/或第一溫度為預(yù)定溫度。例如，預(yù)定溫度可以在約16℃至約37℃的范圍內(nèi)。提供了本概述從而以簡化的形式引入將在以下詳細(xì)描述中進(jìn)一步描述的概念選擇。本概述并非旨在識別出要求保護(hù)的主題的所有關(guān)鍵特征或必要特征，并非旨在用于限定要求保護(hù)的主題的范圍。附圖說明參考附圖來對該詳細(xì)說明進(jìn)行描述。圖1為顯示了DNA片段定向克隆至載體的示例性的流程圖。圖2為顯示了示例性質(zhì)粒的圖。具體實施方式定義除另有定義，本文中所使用的所有科技術(shù)語與本專利技術(shù)所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員所通常理解的具有相同的意義。盡管任何與在本文所描述的那些相似或等同的方法和材料可用于本專利技術(shù)的實行或測試，仍描述了優(yōu)選的方法和材料。出于本專利技術(shù)的目的，以下術(shù)語如下所定義。本文中所使用的冠詞“一”或“一個”是指一個或多于一個(即至少一個)的冠詞的語法對象。舉例來說，“一個因子”意味著一個因子或多于一個的因子。“約”是指與參比數(shù)量、水平、值、數(shù)字、頻率、百分比、維數(shù)、尺寸、量、重量或長度相比，數(shù)量、水平、值、數(shù)字、頻率、百分比、維數(shù)、尺寸、量、重量或長度的變化達(dá)30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。“編碼序列”指的是導(dǎo)致基因多肽產(chǎn)物編碼的任何核酸序列。與之相比，術(shù)語“非編碼序列”是指不會導(dǎo)致基因多肽產(chǎn)物編碼的任何核酸序列。在本專利技術(shù)書中，除了文中另有要求，詞語“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”將被理解為意味包括聲明的步驟或因子或步驟組或因子組，但不排除任何其它步驟或因子或步驟組或因子組。“由...組成”指的是包括但不限于遵照短語“由...組成”的任何內(nèi)容。因此，術(shù)語“由...組成”表示所列的因子是必需的或強制的而沒有存在其它因子。“主要由...組成”指的是包括短語后所列的任何因子，并限于那些對公開中說明的活性或作用不干擾或無貢獻(xiàn)的其它因子。因而，短語“基本上由……組成”表明列出的因子是必需的或強制的，但是其它因子是任選的，依賴是否影響列出因子的活性或存在或不存在。術(shù)語“互補的”和“互補性”是指堿基配對原則關(guān)聯(lián)的多核苷酸(也就是說核苷酸的序列)。例如，序列“A‐G‐T”與序列“T‐C‐A”互補。互補性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的堿基根據(jù)堿基配對原則來進(jìn)行匹配。或，核酸之間可以是“完全”或“總體”的互補性。核酸鏈之間的互補程度顯著影響著核酸鏈之間雜交的效率和強度。“對應(yīng)于(correspondsto)”或“對應(yīng)于(correspondingto)”指的是(a)多核苷酸，該多核苷酸具有與參比多核苷酸序列的全部或一部分基本相同或互補的核苷酸序列，或編碼與肽或蛋白中氨基酸序列相同的氨基酸；或(b)肽或多肽，該肽或多肽具有與參比肽或蛋白的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。“衍生物”指的是通過本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)理解的修飾(例如通過與其它化學(xué)部分(例如，聚乙二醇化)結(jié)合或復(fù)合)或通過翻譯后修飾的技術(shù)從基本序列衍生得到的多肽。術(shù)語“衍生物”也指的是通過修飾、例如通過與其它化學(xué)部分結(jié)合或復(fù)合(例如，聚乙二醇化)從基本結(jié)構(gòu)衍生得到的化合物(例如，糖)。術(shù)語“衍生物”也包括：在其范圍內(nèi)已經(jīng)對親本序列/結(jié)構(gòu)作出的的改變，該改變包括提供功能上等價的分子的添加或缺失。正如在本文中所使用的，術(shù)語“功能”和“功能的”等等是指生物的、的或治療的功能。“基因”指的是在染色體中占據(jù)特異性位點并且由轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)序列和/或編碼區(qū)和/或非翻譯序列(也就是內(nèi)含子，5'和3'的非翻譯序列)組成的遺傳單位。“同源性”是指相同的或構(gòu)成保守性取代的氨基酸的百分比數(shù)字。可以使用諸如GAP的序列對比程序確定同源性(Deveraux等,1984,NucleicAcidsResearch12,387‐395)，其通過引用并入本文。在這一方式中，通過將缺口插入對比，與本文中那些引用的序列相似或基本上不同長度的序列將被對比，例如，通過GAP所使用的比較算法確定此類缺口。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括可以是或已經(jīng)是本專利技術(shù)任何重組的載體或分離的多核苷酸受體的個體細(xì)胞或者細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單個宿主細(xì)胞的子代，并且該子代因正常的、隨機的或有意的突變和/或變化而不必與原母細(xì)胞完全相同(在形態(tài)學(xué)上或總DNA互補上)。宿主細(xì)胞包括使用本專利技術(shù)重組載體或多核苷酸在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。包含本專利技術(shù)重組載體的宿主細(xì)胞為重組宿主細(xì)胞。“分離的”指的是基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含通常在其天然狀態(tài)時與其一起出現(xiàn)的組分的物質(zhì)。例如，正如本文中所使用的“分離的多核苷酸”是指已經(jīng)與天然存在狀態(tài)下的側(cè)翼序列純化分開的多核苷酸，例如，已經(jīng)從正常鄰近該片段的序列中除去的本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種定向克隆的方法，所述方法包括：提供靶載體和插入脫氧核糖核酸(DNA)片段；和在容器中混合所述靶載體、所述插入DNA片段、一定量的限制酶和一定量的DNA連接酶，以：在第一溫度下切割所述靶載體，和在第二溫度下將所述插入DNA片段的至少一部分連接至所述靶載體，其中所述第一溫度與所述第二溫度相同或基本相同。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】1.一種定向克隆的方法，所述方法包括：提供靶載體和插入脫氧核糖核酸(DNA)片段；和在容器中混合所述靶載體、所述插入DNA片段、一定量的限制酶和一定量的DNA連接酶，以：在第一溫度下切割所述靶載體，和在第二溫度下將所述插入DNA片段的至少一部分連接至所述靶載體，其中所述第一溫度與所述第二溫度相同或基本相同。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述插入DNA片段與所述靶載體的所述連接包括將所述插入DNA片段連接至所述靶載體，以產(chǎn)生包括所述靶載體的至少一部分和所述插入DNA片段的所述至少一部分的重組DNA分子。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述重組DNA分子為表達(dá)載體。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述插入DNA片段包括所述插入DNA片段的所述至少一部分和包括所述限制酶的識別位點的DNA序列。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，還包括：在所述第一溫度下切割所述插入DNA片段以產(chǎn)生所述插入片段的所述至少一部分。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中當(dāng)混合所述靶載體、所述插入DNA片段、所述一定量的限制酶、所述一定量的DNA連接酶的時候，所述容器中的所述靶載體分子基本上為閉環(huán)質(zhì)粒。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中對所述靶載體、所述插入DNA片段、所述一定量的限制酶、所述一定量的DNA連接酶的所述混合包括在單一容器內(nèi)混合所述靶載體、所述插入DNA片段、所述一定量的限制酶、所述一定量的DNA連接酶。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳昭，
申請(專利權(quán))人：上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海,31