制備萊鮑迪苷I的方法以及用途技術

在此描述了制備萊鮑迪苷I、包括高度純化的萊鮑迪苷I的方法。這些方法利用將萊鮑迪苷A轉化為萊鮑迪苷I的生物催化劑。還提供了包含萊鮑迪苷I的組合物和消費品，包括甜味劑組合物和風味增強組合物。

The preparation method of rebaudioside I and uses thereof

This describes the preparation of rebaudioside I, including methods of highly purified rebaudioside I. These methods use the rebaudioside A into biological catalyst rebaudiodside I. Also provides a rebaudiodside I composition and consumer products, including sweetener composition and flavor enhancing composition.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】制備萊鮑迪苷I的方法以及用途相關申請的交叉引用本申請要求2014年8月19日提交的美國專利申請號62/039,344的優先權的權益，該專利申請通過引用以其全文結合于此。
本專利技術涉及一種用于制備萊鮑迪苷I的生物催化方法。本專利技術還涉及萊鮑迪苷I作為甜味劑、甜味增強劑和/或風味增強劑的用途。專利技術背景高強度甜味劑具有比蔗糖甜味水平高許多倍的甜味水平。它們基本上無熱量，并且普遍用于飲食和低熱量產品中，包括食品和飲料。高強度甜味劑不引發升糖反應，從而使得它們適合用于針對糖尿病患者和有興趣控制其碳水化合物攝入的其他人群的產品中。甜菊醇糖苷是一類在甜葉菊(SteviarebaudianaBertoni)(原產于南美某些地區的菊科(Asteraceae(Compositae))的多年生灌木)葉中發現的化合物。它們的結構特征在于單個堿，甜菊醇，差異在于位置C13和C19上碳水化合物殘基的存在。它們在甜葉菊的葉子中積累，構成大約10％-20％的總干重。基于干基，在甜葉菊的葉中發現的4種主要糖苷通常包括甜菊苷(stevioside)(9.1％)、萊鮑迪苷A(3.8％)、萊鮑迪苷C(0.6％-1.0％)和杜克苷A(dulcosideA)(0.3％)。森田化學工業有限公司(MoritaKagakuKogyoCo.，Ltd)的WO2010/03911披露了在某些甜菊品種的葉中發現少量的萊鮑迪苷I。WO2010/03911沒有描述分離的萊鮑迪苷I或含有高濃度萊鮑迪苷I的任何組合物的任何感官性質。因此，仍然需要用于制備和純化萊鮑迪苷I的簡單、有效和經濟的方法，特別是當這些方法以商業規模可用時。
技術實現思路
本專利技術提供了一種用于制備萊鮑迪苷I組合物的生物催化方法，該方法包括使包含萊鮑迪苷A的起始組合物與能夠將萊鮑迪苷A轉化為萊鮑迪苷I的生物催化劑接觸。在一個實施例中，生物催化劑是UDP-糖基轉移酶(UGT)。適合的UGT包括但不限于UGT76G1或其變體，其中該變體包含與UGT76G1至少約75％的氨基酸序列一致性。在一個具體的實施例中，UGT76G1變體含有一個或多個點突變，與在相同條件下使用未突變的UGT76G1相比，發現這些點突變將萊鮑迪苷A至萊鮑迪苷A和/或萊鮑迪苷D至萊鮑迪苷M的轉化率提高了至少約5％。適合的突變包括但不限于Q266E、P272A、R334K、G348P、L379G、S42A、F46I、I190L、S274G、I295M、K303G、F314S、K316R、K393R、V394I、I407V、N409K、N409R、Q425E、Q432E、S447A、S456L、I46L、I295M、S119A、S274G、K334R、F314S、K303G、K316R、K393R、I190L、Q425E、Q432E、N138G、V394I、F182L、V407I、A272P、V264C、E449D和A352G。在優選的實施例中，UGT76G1變體選自下組，該組由以下各項組成：UGT76G1-R1-F12、UGT76G1-R2-B9和UGT76G1-R3-G3。生物催化劑可以以任何形式提供，例如像純形式、粗裂解物或全細胞懸液。在另一個替代實施例中，該生物催化劑以微生物提供。起始組合物可以是純形式的萊鮑迪苷A、甜菊醇糖苷混合物或甜葉菊提取物。在一個實施例中，起始組合物是含有按重量計至少約1％萊鮑迪苷A的甜菊醇糖苷混合物或甜葉菊提取物。本專利技術的方法提供了包含按重量計至少約1％萊鮑迪苷I的萊鮑迪苷I組合物。該方法典型地在培養基中進行。因此，該方法可以進一步包括從培養基中分離萊鮑迪苷I組合物以提供分離的萊鮑迪苷I組合物。該方法還可以進一步包括純化步驟，其中將分離的萊鮑迪苷I組合物純化以提供包含按重量計至少約80％萊鮑迪苷I的高度純化的萊鮑迪苷I組合物。在一個實施例中，將分離的萊鮑迪苷I組合物純化以提供純萊鮑迪苷I，即按重量計>99％。本專利技術還提供純萊鮑迪苷I。本專利技術還提供了包含萊鮑迪苷I的組合物。在一個實施例中，本專利技術是包含按重量計從約1％至約99％的量的萊鮑迪苷I的組合物。在一個實施例中，本專利技術是包含按重量計至少約80％的萊鮑迪苷I的高度純化的萊鮑迪苷A組合物。本專利技術還包括使用萊鮑迪苷I作為甜味劑、風味增強劑或甜味增強劑的方法。本專利技術還擴展到包含萊鮑迪苷I的甜味劑組合物、風味增強組合物和甜味增強組合物。還提供了包含萊鮑迪苷I的消費品和包含萊鮑迪苷I的組合物。示例性消費品包括藥物組合物、可食用凝膠混合物或組合物、牙科組合物、甜食、調味組合物、口香糖組合物、谷物組合物、烤焙食品、乳制品、以及桌面(tabletop)甜味劑組合物、飲料或飲料產品。附圖的簡要說明附圖被包括在內以提供對本專利技術的進一步理解。這些附圖展示了本專利技術的實施例，并且與說明書一起用來解釋本專利技術的實施例的原理。圖1示出了萊鮑迪苷I的生物催化生產。圖2示出了使用酶UGT76G1從甜菊苷生物催化生產萊鮑迪苷A，以及伴隨的通過蔗糖合酶進行UDP至UDP-葡萄糖的再循環。圖3示出了UGT76G1催化的甜菊苷到萊鮑迪苷A的轉化。圖4示出了UGT76G1-R1-F12催化的萊鮑迪苷A轉化為萊鮑迪苷I的反應特征曲線。圖5示出了用于將萊鮑迪苷A轉化為萊鮑迪苷I的UGT突變體的活性。圖6示出了純化前的萊鮑迪苷I的HPLC跡線。圖7示出了在4℃下在水中在400ppm的萊鮑迪苷I與萊鮑迪苷M的感官屬性。詳細說明制備萊鮑迪苷I的方法本專利技術提供了一種通過使包含萊鮑迪苷A的起始組合物與能夠將萊鮑迪苷A轉化為萊鮑迪苷I的生物催化劑接觸用于制備萊鮑迪苷I組合物的生物催化方法。萊鮑迪苷I組合物可任選地進一步加工以提供高度純化的萊鮑迪苷I或甚至純萊鮑迪苷I。如本文所用，“起始組合物”是指包含萊鮑迪苷A的任何組合物。通常，起始組合物是水溶液。起始組合物可以是純化的萊鮑迪苷A、甜菊醇糖苷混合物或甜葉菊提取物。含有萊鮑迪苷A的甜菊醇糖苷混合物和甜葉菊提取物、以及高度純化的萊鮑迪苷A可從各種供應商商購，或可通過文獻中提供的方法容易地制備。例如，可口可樂公司(Coca-ColaCompany)的美國專利號8,791,253(其內容通過引用全部并入本文)提供了獲得純度大于95％的萊鮑迪苷A的方法。在一個實施例中，該起始組合物是純化的萊鮑迪苷A，即按重量計>99％。在另一個實施例中，該起始組合物是一種甜菊醇糖苷混合物。甜菊醇糖苷混合物的身份沒有特別限制并且可以包括天然存在的甜菊醇糖苷，例如，甜菊單糖苷、甜菊雙糖苷、甜葉懸鉤子苷、杜克苷B、杜克苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷G、甜菊苷、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷F、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷I、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷H、萊鮑迪苷L、萊鮑迪苷K、萊鮑迪苷J、萊鮑迪苷M、萊鮑迪苷M2、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷D2、萊鮑迪苷N、萊鮑迪苷O；合成甜菊醇糖苷，例如酶促糖基化甜菊醇糖苷及其組合。在一些實施例中，該起始組合物是甜菊醇糖苷混合物或甜葉菊提取物，該甜菊醇糖苷混合物或甜葉菊提取物包含按重量計約1％或更高，例如像約20％或更高、約30％或更高、約40％或更高、約50％或更高、約60％或更高、約70％或更高、約80％或更高或約90％或更高的量的萊鮑迪苷A。在一個具體實施例中，該本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種制備萊鮑迪苷I組合物的方法，包括：a.使包含萊鮑迪苷A的起始組合物與能夠將萊鮑迪苷A轉化為萊鮑迪苷I的生物催化劑接觸以提供包含萊鮑迪苷I的組合物。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.08.19 US 62/039,3441.一種制備萊鮑迪苷I組合物的方法，包括：a.使包含萊鮑迪苷A的起始組合物與能夠將萊鮑迪苷A轉化為萊鮑迪苷I的生物催化劑接觸以提供包含萊鮑迪苷I的組合物。2.如權利要求1所述的方法，其中該生物催化劑是UDP-糖基轉移酶(UGT)。3.如權利要求2所述的方法，其中該UGT是UGT76G1或其含有約75％氨基酸序列一致性或更高一致性的變體。4.如權利要求3所述的方法，其中該UGT76G1變體選自下組，該組由以下各項組成：UGT76G1-R1-F12、UGT76G1-R2-B9和UGT76G1-R3-G3。5.如權利要求3所述的方法，其中該UGT76G1變體包括一個或多個以下點突變：Q266E、P272A、R334K、G348P、L379G、S42A、F46I、I190L、S274G、I295M、K303G、F314S、K316R、K393R、V394I、I407V、N409K、N409R、Q425E、Q432E、S447A、S456L、I46L、I295M、S119A、S274G、K334R、F314S、K303G、K316R、K393R、I190L、Q425E、Q432E、N138G、V394I、F182L、V407I、A272P、V264C、E449D和A352G。6.如權利要求5所述的方法，其中該UGT變體含有以下點突變：Q266E、P272A、R334K、G348P和L379G。7.如權利要求5所述的方法，其中該UGT變體含有以下點突變：Q266E、P272A、R334K、G348P、L379G、S42A、F46I、I190L、S274G、I295M、K303G、F314S、K316R、K393R、V394I、I407V、N409K、N409R、Q425E、Q432E、S447A和S456L。8.如權利要求5所述的方法，其中該UGT變體含有以下點突變：Q266E、P272A、R334K、G348P、L379G、S42A、F46I、I190L、S274G、I295M、K303G、F314S、K316R、K393R、V394I、I407V、N409K、N409R、Q425E、Q432E、S447A、S456L、I46L、I295M、S119A、S274G、K334R、F314S、K303G、K316R、K393R、I190L、Q425E、Q432E、N138G、V394I、F182L、V407I、A272P、V264C、E449D和A352G。9.如權利要求2-8中任一項所述的方法，其中該UGT以選自純化的、粗裂解物或全細胞懸液的形式提供。10.如權利要求2-8中任一項所述的方法，其中該UGT以微生物提供。11.如權利要求1所述的方法，其中萊鮑迪苷A以純形式提供。12.如權利要求1所述的方法，其中萊鮑迪苷A以含有按重量計至少約1％的萊鮑迪苷A的甜菊醇糖苷混合物或甜葉菊提取物提供。13.如權利要求12所述的方法，其中萊鮑迪苷A以含有按重量計至少約80％的萊鮑迪苷A的甜菊醇糖苷混合物或甜葉菊提取物提供。14.如權利要求1所述的方法，其中該萊鮑迪苷I組合物包含按重量計大于約1％的萊鮑迪苷I。15.如權利要求1所述的方法，進一步包括分離萊鮑迪苷I以提供分離的萊鮑迪苷I組合物。16.如權利要求15所述的方法，進一步包括純化所分離的萊鮑迪苷I組合物以提供高度純化的萊鮑迪苷I。17.如權利要求15所述的方法，進一步包括純化所分離...

【專利技術屬性】
技術研發人員：因德拉·普拉卡什，辛西婭·邦德斯，阿韋季克·馬爾科相·馬爾科相，西里爾·加林，羅伯特·特爾·哈雷，
申請(專利權)人：可口可樂公司，譜賽科有限責任公司，
類型：發明
國別省市：美國,US