本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的A549裸鼠模型及其建立與應(yīng)用，所述裸鼠模型通過(guò)采用基因重組技術(shù)和慢病毒感染將螢火蟲(chóng)熒光素酶基因引入人肺腺癌A549細(xì)胞株中，通過(guò)亞克隆篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的腫瘤克隆細(xì)胞株，然后采用重組的A549細(xì)胞接種于小鼠構(gòu)建而成。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)與傳統(tǒng)的腫瘤模型藥物效果檢測(cè)方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進(jìn)行活體觀察而不損傷動(dòng)物，結(jié)果更加可靠，具有良好的應(yīng)用前景。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的A549裸鼠模型及其建立與應(yīng)用
本專(zhuān)利技術(shù)屬于裸鼠模型及其建立與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的 A549裸鼠模型及其建立與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
肺癌是威脅我國(guó)人民健康的頭號(hào)殺手。據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的《2010年中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒》，我國(guó)2009年惡性腫瘤在所有疾病死亡原因中居首位，統(tǒng)計(jì)資料顯示死亡率排名前十位的惡性腫瘤中，肺癌居首位，為我國(guó)的社會(huì)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，肺癌的治療和基礎(chǔ)研究取得了較大發(fā)展，但目前肺癌藥物的基礎(chǔ)和臨床前研究尚欠缺一種能更方便的評(píng)估藥物療效的可靠的體內(nèi)、體外研究平臺(tái)，這嚴(yán)重制約了肺癌的基礎(chǔ)和臨床前研究。肺癌動(dòng)物模型是肺癌研究的重要手段，移植性肺癌模型是目前臨床前藥物實(shí)驗(yàn)最常用的模型。 移植型肺癌模型是將人肺癌細(xì)胞移植到動(dòng)物體內(nèi)傳代生長(zhǎng)，移植的腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、 染色體數(shù)量、同工酶水平等將保持不變，對(duì)臨床抗癌藥物敏感性也大致相同，移植型肺癌模型建立的常用方法是皮將肺癌細(xì)胞或組織塊接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下(腋部、背部、后肢等)建立肺癌模型。此模型建模簡(jiǎn)單易行，成瘤率高，易監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)情況， 所以常用來(lái)作抗癌藥物篩選的動(dòng)物模型，同時(shí)該模型還具有動(dòng)物來(lái)源方便、移植腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速、倍增時(shí)間短、耗費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)。但目前應(yīng)用的移植型肺癌模型對(duì)藥物療效的評(píng)估多需采取解剖的方法進(jìn)行評(píng)估，操作復(fù)雜，受人為操作的影響因素大，不便于臨床前研究。如果能夠建立一種整體可視化肺癌模型，能夠直接進(jìn)行體外成像·監(jiān)測(cè)評(píng)估腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移情況，可以對(duì)活體動(dòng)物進(jìn)行觀察，將大大便利肺癌的臨床前研究，同時(shí)也能減少人為因素的干擾，提高評(píng)估的準(zhǔn)確性。熒光素酶報(bào)告基因(Luc)的應(yīng)用便利了肺癌整體可視化動(dòng)物模型的構(gòu)建。熒光素酶報(bào)告基因根據(jù)來(lái)源不同主要分為細(xì)菌熒光素酶(Bacterial luciferase, BL)、螢火蟲(chóng)熒光素酶(fireflyluciferase’FL)以及海星、發(fā)光魚(yú)、發(fā)光甲蟲(chóng)等為來(lái)源的熒光素酶，目前研究最廣泛并且成為商品酶的是BL和FL。BL是由2個(gè)多肽亞基組成的異二聚體，相對(duì)分子質(zhì)量約為79X 103。在還原性黃素(FMNH)、八碳以上長(zhǎng)鏈脂肪醛(RCHO)和氧分子(O2)存在時(shí)，發(fā)射出藍(lán)綠光(45(T490nm)。FL由單一的多肽鏈組成，相對(duì)分子質(zhì)量為(60 64) XlO3, 在Mg2+、ATP、O2存在時(shí)催化D-熒光素(D-Luciferin)氧化脫羧發(fā)光(55(T580nm)。螢火蟲(chóng)的熒光素_熒光素酶系統(tǒng)是最早建立的發(fā)光模型之一，該發(fā)光系統(tǒng)采用熒光素底物發(fā)光的形式，不需要激發(fā)光，具有較高的靈敏度，此外，螢火蟲(chóng)熒光素酶發(fā)出的光組織吸收少，有利于深部組織成像，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量呈線(xiàn)性相關(guān)。通過(guò)基因工程方法構(gòu)建熒光素酶的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染到癌細(xì)胞中，使其表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶，進(jìn)而利用表達(dá)熒光素酶的癌細(xì)胞接種至動(dòng)物即可構(gòu)建整體可視化腫瘤模型，可通過(guò)體外成像的方法，對(duì)動(dòng)物體進(jìn)行活體觀察而不損傷動(dòng)物。慢病毒感染較其他轉(zhuǎn)染方式具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，具有感染譜廣、效率高、可感染非分裂細(xì)胞、并可使目的基因穩(wěn)定整合至宿主基因組因而能夠長(zhǎng)期表達(dá)、免疫反應(yīng)小等特點(diǎn)，是一種高效的基因轉(zhuǎn)移工具。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的A549裸鼠模型及其建立與應(yīng)用，與傳統(tǒng)的腫瘤模型藥物效果檢測(cè)方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進(jìn)行活體觀察而不損傷動(dòng)物，結(jié)果更加可靠，具有良好的應(yīng)用前景。本專(zhuān)利技術(shù)的一種穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的A549裸鼠模型，所述腫瘤模型通過(guò)采用基因重組技術(shù)和慢病毒感染將螢火蟲(chóng)熒光素酶基因引入人肺腺癌A549細(xì)胞株中，通過(guò)亞克隆篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的腫瘤克隆細(xì)胞株，然后采用重組的A549細(xì)胞接種于小鼠構(gòu)建而成。本專(zhuān)利技術(shù)的一種穩(wěn)定表達(dá)突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,包括(I)以前期構(gòu)建的攜帶有螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出熒光素酶的cDNA，通過(guò)基因克隆的方法插入慢病毒真核表達(dá)載體PRRL-CMV質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒 Luc-PRRL-CMV 表達(dá)質(zhì)粒設(shè)計(jì)螢火蟲(chóng)熒光素酶基因特異性引物(該引物為上游引物CCTTCTAGAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG;下游引物CCTGTC GACTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTC)；熒光素酶基因的克隆和慢病毒載體的構(gòu)建使用該特異性引物PCR擴(kuò)增螢火蟲(chóng)熒光素酶基因并克隆至PCR-Blunt克隆載體中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒抽提后運(yùn)用基因重組方法將熒光素酶目的基因片段插入慢病毒真核表達(dá)載體PRRL-CMV空質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；質(zhì)粒抽提后進(jìn)行雙酶切和測(cè)序證實(shí)構(gòu)建的表達(dá)載體的正確性；(2)慢病毒感染方法將熒光素酶外源基因?qū)敕伟┘?xì)胞株的步驟大腸桿菌擴(kuò)增熒光素酶慢病毒載體和慢病毒包裝質(zhì)粒，并純化測(cè)定濃度；將熒光素酶慢病毒載體的包裝熒光素酶慢病毒表達(dá)載體與慢病毒包裝質(zhì)粒混合后，用轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以產(chǎn)生含有螢火蟲(chóng)熒光素酶慢病毒顆粒的上清，確定慢病毒顆粒的滴度；病毒感染以人肺腺癌A549為母細(xì)胞，用上述病毒上清進(jìn)行感染；擴(kuò)增建系進(jìn)行細(xì)胞亞克隆篩選，檢測(cè)單克隆細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)情況，篩選出穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的重組細(xì)胞株并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；(3)腫瘤皮下注射方法將得到的重組人肺腺癌細(xì)胞經(jīng)消化后重懸于氯化鈉溶液中(200 μ 1)，在裸鼠皮下接種(2Χ IO6)該重組人肺腺癌細(xì)胞，監(jiān)測(cè)細(xì)胞皮下增殖情況，即得到穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的 Α549細(xì)胞株。所述步驟(I)中的基因重組方法為酶切和連接；其中，酶切具體為采用Xba I和 Sal I雙酶切。所述步驟(2)中的熒光素酶慢病毒表達(dá)載體與慢病毒包裝質(zhì)粒的質(zhì)量比為1:3、 1:6 或 1:9。所述慢病毒包裝質(zhì)粒包括第三代慢病毒復(fù)制所需要的三個(gè)基因gag、pol和rev。所述步驟(2)中的轉(zhuǎn)染試劑為MV40轉(zhuǎn)染試劑。所述步驟(2)中通過(guò)ELISA法確定慢病毒顆粒的滴度；通過(guò)細(xì)胞有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞亞克隆篩選；通過(guò)熒光測(cè)定儀或活細(xì)胞成像儀檢測(cè)單克隆細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)情況。所述步驟(3)中的氯化鈉溶液質(zhì)量百分比濃度為O. 9%。所述步驟(3)中通過(guò)游標(biāo)卡尺測(cè)量和活體成像儀監(jiān)測(cè)細(xì)胞皮下增殖情況。本專(zhuān)利技術(shù)的裸鼠模型應(yīng)用于觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況和抗腫瘤藥物的治療效果。所選用的動(dòng)物除了裸鼠，也可以為SCID鼠。有益.效果本專(zhuān)利技術(shù)與傳統(tǒng)的腫瘤模型藥物效果檢測(cè)方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進(jìn)行活體觀察而不損傷動(dòng)物，結(jié)果更加可靠，具有良好的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖IA為螢火蟲(chóng)熒光素酶Luciferase慢病毒載體示意圖IB為質(zhì)粒酶切鑒定圖2為L(zhǎng)uciferase慢病毒載體的包裝；其中，A為目的基因質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒按1:3轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，B為目的基因質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒按1:6轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，C為目的基因質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒按1:9轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；圖3為包裝后的慢病毒上清感染A549細(xì)胞72h ；圖4為穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的A549細(xì)胞單克隆篩選；其中，A為L(zhǎng)uciferase活性定量分析(RLU)，B為活細(xì)胞成像；圖5為穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的A549細(xì)胞系生物學(xué)特性分析(劃痕試驗(yàn))；圖6為穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的A549本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的A549裸鼠模型，其特征在于：所述裸鼠模型通過(guò)采用基因重組技術(shù)和慢病毒感染將螢火蟲(chóng)熒光素酶基因引入人肺腺癌A549細(xì)胞株中，通過(guò)亞克隆篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的腫瘤克隆細(xì)胞株，然后采用重組的A549細(xì)胞接種于小鼠構(gòu)建而成。
【技術(shù)特征摘要】
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：房健民，周爽，楊洋，李棟，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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