一種內切葡聚糖酶編碼基因和重組酶及應用制造技術

本發明專利技術公開了一種內切葡聚糖酶編碼基因和重組酶及應用，屬于生物技術領域。一種內切葡聚糖酶編碼基因，其序列如SEQ?ID?NO.1；內切葡聚糖酶的重組酶其序列如SEQ?ID?NO.2所述。實驗證明，本發明專利技術的重組內切葡聚糖酶具有很高的羧甲基纖維素酶活性，達到2245U/mL，菌落的透明圈直徑是原始菌株的30倍以上。本發明專利技術所提供的內切葡聚糖酶編碼基因和重組酶可廣泛應用于纖維素的降解。

【技術實現步驟摘要】
—種內切葡聚糖酶編碼基因和重組酶及應用
本專利技術屬于生物
，涉及一種內切葡聚糖酶編碼基因和重組酶及應用。
技術介紹
纖維素是生物圈中產量最豐富的一種碳水化合物資源，占植物干重的35%_50%， 分布廣泛。纖維素呈長鏈狀高分子，由葡萄糖苷通過β-1，4糖苷鍵連接而成，分子量一般為50000-2500000，相當于300-15000個葡萄糖單位，是葡萄糖的一種重要貯存形式，但是由于降解困難，導致纖維素資源的利用率非常的低。纖維素大分子可被纖維素酶所降解。纖維素酶是一個酶系，根據其催化反應功能的不同，可以把纖維素分為內切葡聚糖酶(endo-l, 4_ β -D-glucanase, EC3. 2. I. 4,即 Cl 酶)，外切葡聚糖酶(1，4- β -D-glucan celIobiIhydrolase 或 exo_l, 4_β -D-glucannase, EC. 3. 2. I. 91),和 β -葡聚糖苷酶 (β -I, 4-glucosidase，EC. 3. 2. I. 21)簡稱BG。一般認為，內切葡聚糖酶是纖維素酶系中最重要的酶，可以作用于纖維素分子內的無定形區，隨機水解糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截成短鏈狀，產生小分子纖維素，可以為外切酶提供大量的反應末端，同時還能水解小分子的纖維素寡糖。纖維素酶的研究與開發是纖維素資源綜合利用的基礎。目前研究者對真菌的纖維素酶研究開發較多，而在細菌中開發高效纖維素酶系的研究要少很多。纖維素降解細菌的研究大多是芽胞桿菌類，在Pantoea ananatis中的研究未有報道。隨著分子生物學、基因工程的迅猛發展，國內外均嘗試應用基因工程技術來構建高效纖維素降解菌株、開發新型高效的纖維素酶系。由于內切葡聚糖酶在纖維素酶系中的重要地位，因此需要通過生物技術方法加大對細菌內切葡聚糖酶的研究，構建重組內切葡聚糖酶工程菌，并開展酶學性質、 酶產品的研究，以推動纖維素酶的應用和纖維素資源的開發利用。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種新型內切葡聚糖酶編碼基因eg的基因序列及其氨基酸序列。采用PCR方法克隆獲得內切葡聚糖酶編碼基因。本專利技術的一種新型內切葡聚糖酶編碼基因eg，所述內切葡聚糖酶的基因序列為 SEQ ID NO. I。所述內切葡聚糖酶的基因eg是一個完整的開放閱讀框(0RF)，該開放閱讀框以啟始密碼子ATG開始，以終止密碼子TGA結束，共包括1005bp。本專利技術的一種新型重組內切葡聚糖酶，所述重組酶的氨基酸序列為SEQ IDN0. 2。所述內切葡聚糖酶共334個氨基酸序列。本專利技術的另一目的，在于提供一種新型重組內切葡聚糖酶EG。該重組酶具有很高的酶活性，達到2245U/mL。上述重組內切葡聚糖酶EG的制備方法，包括如下步驟(I)重組內切葡聚糖酶菌株EG/BL21(DE3)的構建以 F: CATATGAGAGTTAAGCCAGTGT 和 R: CTCGAGACGCTTTTCCTGATAA 為 PCR 反應的引物；以PCR方法從菌株Pantoea ananatis P5 (CGMCCN0. 5356)基因組中克隆獲得內切葡聚糖酶編碼基因eg全長，將該基因通過限制性內酶NdeI和XhoI酶切后，連接到原核表達載體PET258中，構建重組質粒pETEG，轉化大腸埃希氏菌E. coli BL21(DE3)感受態細胞，利用PCR反應檢測(引物為F和R)和限制性內切酶NdeI和XhoI雙酶切檢測兩種方法，篩選獲得高效表達重組內切葡聚糖酶的菌株，即重組大腸埃希氏菌EG/BL21 (DE3)；(2)重組菌株EG/BL21 (DE3)的發酵培養與誘導表達將重組菌株EG/BL21 (DE3)按1%接種量轉接到50mL LB (含30 μ g/mL卡那霉素) 液體培養基中于37°C震蕩培養；待0D_為O. 5時，加入O. ImM異丙基-β -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)誘導4h終止發酵；將發酵液在_80°C速凍，放冰水中緩慢融化完全，使用超聲波破碎細胞，10000r/min離心5min，取上清即為粗酶液；(3)重組內切葡聚糖酶的純化將上清加到Ni-NTA柱上，使帶有His標簽的重組內切葡聚糖酶結合到柱子上；使用PH8. O的洗脫溶液(含50mM NaH2PO4,300mM NaCl、250mMimidazole)將重組內切葡聚糖酶從柱子上洗脫下來，并將酶液在超離心濃縮管中濃縮，獲得純度高于95%以上的內切葡聚糖酶蛋白。本專利技術的再一目的，在于提供上述新型重組內切葡聚糖酶EG的應用。所述內切葡聚糖酶能夠應用于生產纖維素酶，應用于纖維素的降解。本專利技術與現有技術相比，具有如下優點和有益效果(I)根據酶基因序列BLAST分析結果結合酶的分子量、等電點和酶學特性等特性與已知蛋白的差異判斷，該重組內切葡聚糖酶EG是一種新型β-1，4-內切葡聚糖酶基因。 這是首次從Pantoea ananatis菌株中開發出重組β-1,4-內切葡聚糖酶基因。(2)該重組內切葡聚糖酶EG具有適應溫度范圍廣、耐較強酸堿性的特點，在生物能源、洗衣紡織、食品加工、發酵生產等多個行業中具有應用潛力。附圖說明圖I是內切葡聚糖酶基因的克隆與檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖。I :內切葡聚糖酶基因PCR擴增結果；2 :菌落PCR鑒定陽性結果；3 =NdeI和Xho I 雙酶切割過的重組質粒，小帶是切出的目的基因，大帶是空載體；4 =NdeI單酶切的重組質粒；5 =Xho I單酶切的重組質粒；6 :沒切割的重組質粒對照；M1 :1KB，從上到下一次大小為；10kb，8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，Ikb ；M2 D2000,從上到下一次大小為 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp ;重組內切葡聚糖酶基因以左側箭頭標出。圖2是重組菌株EG/BL21(DE3)在羧甲基纖維素鈉培養基上形成的透明圈圖。圖3是重組菌株EG/BL21 (DE3)內切葡聚糖酶蛋白誘導表達的SDS-PAGE圖。圖中1 :誘導前；2 :誘導3hr ；3 :誘導4hr ；4 :誘導5hr ；M :蛋白Marker,大小標于左側；重組內切葡聚糖酶蛋白以右側箭頭標出)圖4是重組內切葡聚糖酶純化的SDS-PAGE圖。圖中1 :誘導前；2 :誘導4hr ；3 :純化的重組內切葡聚糖酶蛋白。具體實施方式I、主要材料(I)培養基LB液體培養基每L培養基中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaClIOg ；LB固體培養基每L培養基中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaClIOg瓊脂粉12g ；產透明圈培養基每IL培養基中含有羧甲基纖維素鈉10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，KH2PO4 lg, MgSO4 O. 2g，NaCl 10g，葡萄糖 2g，瓊脂粉 12g ；(2)實驗儀器設備YXQ-LS-75立式壓力蒸汽滅菌鍋——上海博訊實業有限公司醫療設備廠PCR擴增儀——美國ABI公司FA2004電子天平——上海越平科學儀器有限公司DNP-9162型電熱恒溫培養箱——上海精宏實驗設備有限公司YXJ-2高速離心機——常州國華電器有限公司Sigma3 16pk臺式聞速冷凍尚;L·、機德國SIGMA公司低速離心機——常州國華本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種重組內切葡聚糖酶編碼基因，其特征在于：所述酶基因序列為SEQ？IDNO.1。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：侯進慧，劉彤，陳宏偉，王富威，
申請(專利權)人：徐州工程學院，
類型：發明
國別省市：