本發(fā)明專利技術(shù)提供具有改良型腈水合酶活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過改變腈水合酶的氨基酸序列得到，與野生型腈水合酶活性相比耐熱性提高；本發(fā)明專利技術(shù)還提供編碼該蛋白質(zhì)的基因DNA，具有該基因DNA的重組載體，具有該重組載體的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體，提取自該轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體培養(yǎng)物的腈水合酶及其制備方法，以及酰胺化合物的制備方法。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及具有耐熱性提高或底物特異性改變的改良型腈水合酶活性的蛋白質(zhì)；編碼該蛋白質(zhì)的基因DNA ;具有該基因DNA的重組載體；具有該重組載體的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體；提取自該轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體培養(yǎng)物的腈水合酶及其制備方法；以及使用了該培養(yǎng)物或該處理物的酰胺化合物的制備方法。
技術(shù)介紹
近年來，人們發(fā)現(xiàn)了具有腈水合活性的酶——腈水合酶，該酶可通過水合作用將腈基轉(zhuǎn)換為酰胺基，并且公開了利用該酶或具有該酶的微生物菌體以腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物的方法。與以往的化學(xué)合成方法相比，這種制備方法因具有高度的由腈化合物轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的酰胺化合物的轉(zhuǎn)化率和選擇率而為人所知。生產(chǎn)腈水合酶的微生物，可列舉例如屬于棒桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、假諾卡氏屬(Pseudonocardia)等的微生物。其中玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1株已用于丙烯酰胺的工業(yè)生產(chǎn),其有效性已被證實。另外，編碼生產(chǎn)該菌株的腈水合酶的基因也已查明(請參考專利文獻(xiàn)I)。從降低反應(yīng)時酶的用量和降低成本的觀點出發(fā)，期待能獲取耐熱性進(jìn)一步提高的酶。另一方面，不僅是利用從自然界存在的微生物離析得到的腈水合酶或其基因，出于改變腈水合酶的活性、底物特異性、Vmax, Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性等目的，人們嘗試對腈水合酶引入突變。(參考專利文獻(xiàn)2和3)專利文獻(xiàn)1:特許第3162091號公報專利文獻(xiàn)2:國際公開2004/056990號手冊(pamphlet)專利文獻(xiàn)3:特開2004-222538號公報
技術(shù)實現(xiàn)思路
·腈水合酶是已用于丙烯酰胺工業(yè)生產(chǎn)的酶，但獲取耐熱性等性質(zhì)較目前所使用的酶進(jìn)一步提高的酶可降低酶反應(yīng)時的成本。因此，本專利技術(shù)的目的在于進(jìn)一步改良腈水合酶，提供耐熱性更為提高的具有腈水合酶活性的蛋白質(zhì)，編碼該蛋白質(zhì)的基因DNA，具有該基因DNA的重組載體，具有該重組載體的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體，提取自該轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體培養(yǎng)物的腈水合酶及其制備方法以及使用了該培養(yǎng)物或處理物的酰胺化合物的制備方法。另外,玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1株的腈水合酶雖然已用于以丙烯腈為原料的丙烯酰胺的工業(yè)生產(chǎn)，但對于芳香腈反應(yīng)活性低，在期待開發(fā)出對于芳香腈反應(yīng)活性高的酶的同時，從降低催化劑成本的觀點出發(fā)，也期待開發(fā)出熱穩(wěn)定、不易失活的酶。因此，本專利技術(shù)以改良腈水合酶獲得耐熱性提高的酶以及/或者獲得對芳香腈反應(yīng)活性提高的酶為目的。本專利技術(shù)人為解決上述課題經(jīng)過深入研究，發(fā)現(xiàn)在來源于玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1株的腈水合酶的氨基酸序列中，通過將其中至少一個以上的氨基酸殘基用選自天然氨基酸組的殘基取代，該酶耐熱性得以提高以及/或者對芳香腈的反應(yīng)活性得以提高，從而完成了本專利技術(shù)。即，本專利技術(shù)如下所述: (I) 一種蛋白質(zhì)，是野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列上第93位谷氨酸殘基被其他氨基酸殘基取代并且具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質(zhì)，所述其他氨基酸殘基是選自甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸中的任意一個氨基酸殘基，所述野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列如SEDIDNO:2所示。(2)上述(I)中所述的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步地，β亞基的第103位谷氨酸殘基被天冬氨酸殘基取代。(3)上述(I)中所述的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步地，野生型腈水合酶的α亞基的氨基酸序列上，第132位天冬氨酸殘基被天冬酰胺殘基取代，所述野生型腈水合酶的α亞基的氨基酸序列如SED ID NO -A所示。(4) 一種DNA，編碼上述⑴-⑶中任意一項所述的蛋白質(zhì)。(5) 一種重組載體，含有上述⑷所述的DNA。(6) 一種轉(zhuǎn)化體，含有上述(5)所述的重組載體。(7) 一種制備腈水合酶的方法，其特征在于，培養(yǎng)上述(6)所述的轉(zhuǎn)化體，從所得培養(yǎng)物提取腈水合酶。(8) 一種制備酰胺化合物的方法，培養(yǎng)上述(6)所述的轉(zhuǎn)化體，使所得的培養(yǎng)物或該處理物與腈基化合物接觸，提取通過該接觸生成的酰胺化合物。本專利技術(shù)提供與野生型腈水合酶相比耐熱性提高以及/或者對于芳香腈反應(yīng)活性提高的突變型腈水合酶以及編碼該酶的基因。本專利技術(shù)進(jìn)一步提供具有上述突變型腈水合酶基因的重組DNA，具有該重組DNA的轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)導(dǎo))體，使用該轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)導(dǎo))體制備酰胺化合物的方法。通過本專利技術(shù)，可以高效制備丙烯酰胺。附圖說明圖1為質(zhì)粒pJH601的組成圖。圖2為質(zhì)粒p3R的組成圖。圖3為質(zhì)粒pMH301的組成圖。圖4為質(zhì)粒p52的組成圖。圖5A為質(zhì)粒pCF002的組成圖。圖5B為質(zhì)粒pFY529的組成圖。具體實施例方式以下詳細(xì)說明本專利技術(shù)。本說明書中所引用的文獻(xiàn)、公開公報、國際公開公報等其他專利公報作為參照并入本說明書。<腈水合酶>本專利技術(shù)通過使野生型腈水合酶的氨基酸序列部分突變，提供與野生型腈水合酶相比耐熱性和/或底物特異性提高的改良型腈水合酶。“腈水合酶”是催化腈化合物轉(zhuǎn)化為對應(yīng)酰胺化合物的水合反應(yīng)(RCN+H20 - RCONH2)的酶。另外，“腈水合酶”的結(jié)構(gòu)是由α亞基與β亞基聚合形成的高級結(jié)構(gòu)。“野生型腈水合酶”指具有來源于作為酶源的微生物的野生株(親株)的氨基酸序列的腈水合酶以及來源于野生株(親株)的基因序列編碼所得的腈水合酶。“野生型β亞基”或“野生型α亞基”指具有來源于野生株(親株)的氨基酸序列的β亞基或α亞基以及來源于野生株(親株)的基因序列編碼所得的β亞基或α亞基。“野生型腈水合酶”可列舉來源于各種微生物野生型的腈水合酶。微生物不僅限于具有編碼腈水合酶的基因的微生物。優(yōu)選具有來源于紅球菌屬微生物的氨基酸序列的腈水合酶以及來源于紅球菌屬微生物的基因序列編碼所得的腈水合酶，所述紅球菌屬微生物例如可列舉玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1 (FERM BP-1478)、玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) M8 (SU1731814)、玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M3 3 (VKM Ac_1515D)或玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) ATCC39484 (特開平2001-292772)等。或者是來源于史密氏桿菌(Bacillus smithii)(特開平09-248188)的腈水合酶亦可。特別優(yōu)選的是具有來源于玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1或玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8的氨基酸序列的腈水合酶以及來源于這兩株的基因序列編碼所得的腈水合酶。另外，玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M33 (VKM Ac-1515D)菌是由M8 (SU1731814)菌通過自然突變產(chǎn)生的作為腈水合酶表達(dá)株而被篩選出的菌株。該菌株的腈水合酶本身的氨基酸序列和基因序列沒有突變(美國專利第5827699 號)。在此，耐熱性提高指來源于突變株的加熱處理后的酶的殘留活性本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種蛋白質(zhì)，是野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列上第93位谷氨酸殘基被其他氨基酸殘基取代并且具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質(zhì)，所述其他氨基酸殘基是選自甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸中的任意一個氨基酸殘基，所述野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列如SED?ID?NO：2所示。
【技術(shù)特征摘要】
2004.05.26 JP 2004-156593;2004.08.18 JP 2004-23781.一種蛋白質(zhì)，是野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列上第93位谷氨酸殘基被其他氨基酸殘基取代并且具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質(zhì)， 所述其他氨基酸殘基是選自甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸中的任意一個氨基酸殘基， 所述野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列如SED ID Ν0:2所示。2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步地，β亞基的第103位谷...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：渡邊文昭，氏原大，酒井美紀(jì)，湯不二夫，中村哲二，
申請(專利權(quán))人：DiaNitrix株式會社，
類型：發(fā)明
國別省市：
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