本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種水稻果皮顏色基因Pb的分子標(biāo)記和應(yīng)用，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)的分子標(biāo)記通過一條正向引物和兩條反向引物PCR擴增得到，前述引物的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.1?3所示。利用該水稻果皮顏色基因Pb的分子標(biāo)記，只需通過簡單的PCR即可完成對水稻果皮顏色基因Pb的基因分型，預(yù)測水稻果皮顏色。本發(fā)明專利技術(shù)具有操作簡便、分型快速、費用低廉等優(yōu)勢，更適合在大規(guī)模分子標(biāo)記輔助選擇中運用。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于植物生物
，具體地說，涉及一種水稻果皮顏色基因Pb的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
水稻是我國最重要的糧食作物之一，全國有超過一半的人口以稻米為主食。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們對膳食營養(yǎng)品質(zhì)的要求逐漸提高，稻米營養(yǎng)品質(zhì)也受到越來越多的重視。紫米是一種具有較高營養(yǎng)價值的有色稻米。相較于一般白米不含有花色素苷，紫米果皮內(nèi)積累了包括矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷在內(nèi)的大量花色素苷，使其糙米呈紫色或黑色。花色素苷屬于類黃酮物質(zhì)，具有較強的抗氧化作用，能夠有效清除活性氧自由基、羥自由基和DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基。與白米相比，紫米還含有豐富的膳食成分，包括人體必需氨基酸、植物脂肪、纖維素和鐵、鈣、鋅等礦物質(zhì)，尤其含有一般稻米缺乏的維生素C和胡蘿素等。研究表明紫米具有抗癌和抑制腫瘤活性，減輕糖尿病并發(fā)癥，減輕支氣管病和心血管病病癥，改善缺鐵性貧血，抗過敏，消炎等功效。紫米的果皮顏色性狀是由Pb和Pp兩個基因共同調(diào)控的。當(dāng)同時帶有Pb和Pp時，果皮為紫色；當(dāng)帶有Pb不帶有Pp時，果皮為棕色；當(dāng)不帶有Pb時，不論Pp是否存在果皮均為白色(Rahman M M，Lee K E，Lee E S，et al.The genetic constitutions of complementary genes Pp and Pb determine the purple color variation in pericarps with cysnidin-3-O-glucoside depositions in black rice.J Plant Biol，2013，56(1)：24-31)。Pp定位于第1染色體(Hu J，Anderson B，Wessler S R.Isolation and characrerization of rice R genes：Evidence for distinct evolutionary paths in rice and maize.Genetics，1996，142(3)：
1021-1031；)。Pb定位于第4染色體兩個InDel標(biāo)記RID3與RID4之間約25kb范圍內(nèi)，并被推測與前人報道的Ra為同一個基因。進一步研究表明Ra第7外顯子內(nèi)一個2bp(GT)片段的缺失是造成紫色果皮的原因(王彩霞，舒慶堯.水稻紫色種皮基因Pb的精細定位與候選基因分析.科學(xué)通報，2007，52(21)：2517-2523)。DNA分子標(biāo)記是指能反映生物個體或種群間基因組遺傳差異的特異DNA片段。對于基因組中核苷酸序列已知的小片段插入缺失類型的遺傳差異一般可使用特異引物PCR標(biāo)記進行檢測，例如STS(sequnce-tagged site)標(biāo)記，引物擴增受阻突變體系PCR標(biāo)記，CAPS(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences)標(biāo)記，dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)標(biāo)記等。STS標(biāo)記是根據(jù)遺傳差異兩側(cè)已知的核苷酸序列設(shè)計PCR引物進行擴增獲得DNA分子標(biāo)記，然后電泳分析遺傳標(biāo)記多態(tài)性的方法。引物擴增受阻突變體系PCR標(biāo)記是針對已知的變異位點設(shè)計一條或一對外引物和兩條內(nèi)引物，其中外引物在突變位點一側(cè)或雙側(cè)，內(nèi)引物3’末端堿基必須剛好落在變異位點上或離變異位點數(shù)個堿基的位置上。通過內(nèi)引物3’末端堿基與野生型和突變體基因組同源配對程度的不同選擇性擴增野生型和突變型基因(管峰，艾君濤，楊利國.一種SNP檢測新方法:四引物擴增受阻突變體系PCR技術(shù).生命的化學(xué)，2004，24(6)：514-516；王忠華，Redus MARC，賈育林.水稻抗稻瘟病基因Pi-ta共顯性分子標(biāo)記的建立.中國水稻科學(xué)，2005，19(6)：483-488)。CAPS標(biāo)記是首先擴增出包含遺傳差異位點的PCR產(chǎn)物，然后用限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，再電泳檢測酶切片段的多態(tài)性。CAPS標(biāo)記的設(shè)計依賴于在遺傳差異位點剛好存在限制性內(nèi)切酶位點，如果遺傳差異位點內(nèi)不存在限制性酶切位點則可以通過PCR引入酶切位點然后按CAPS標(biāo)記的方法檢測，這就是dCAPS標(biāo)記。通過對與目標(biāo)基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記進行檢測，可以
在雜交后代中準(zhǔn)確地對不同個體的基因型進行鑒定，并進一步預(yù)測目標(biāo)基因所控制的性狀以幫助后代選擇，這就是分子標(biāo)記輔助選擇。紫色果皮屬于顯性性狀，傳統(tǒng)育種只能在水稻灌漿后才能對該性狀進行選擇，并且只能通過后代分離情況才能區(qū)分純雜合基因型，選擇效率低下。根據(jù)Ra/Pb第7外顯子內(nèi)GT片段的缺失，研究者開發(fā)出了CAPS標(biāo)記CAPSRa和CAPSPb用于對紫色種皮性狀的標(biāo)記輔助選擇。CAPSRa標(biāo)記可以分別從GT缺失基因型和野生型材料中擴增出858bp和860bp的片段。其中858bp片段可被BamH I酶切為653bp和203bp的兩條片段，而860bp片段不能被BamH I酶切。CAPSPb標(biāo)記可以從GT缺失基因型和野生型材料中分別擴增出1198bp和1200bp的片段。其中1198bp片段可被BamH I酶切為669bp和529bp的兩條片段，而1200bp片段不能被BamH I酶切。雖然CAPSRa和CAPSPb標(biāo)記極大提高了紫米品種的選擇效率，但是CAPS標(biāo)記操作繁瑣、檢測費時、成本較高的缺點并不利于該類標(biāo)記在育種中大規(guī)模應(yīng)用。因此在紫米品種選育過程中，迫切需要一種操作簡單、快速、準(zhǔn)確且高通量的鑒定果皮顏色的分子標(biāo)記方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點與不足，提供一種水稻果皮顏色基因Pb的分子標(biāo)記。本專利技術(shù)的第二個目的是提供利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻果皮顏色基因Pb基因型的方法及其應(yīng)用。本專利技術(shù)的第三個目的是提供利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻果皮顏色或同時鑒定水稻果皮顏色基因Pb基因型和水稻果皮顏色的方法及其應(yīng)用。本專利技術(shù)提供的一種水稻果皮顏色基因Pb的分子標(biāo)記，其通過核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物擴增得到。本專利技術(shù)提供了上述分子標(biāo)記在鑒定水稻果皮顏色基因Pb基因型
中的應(yīng)用。本專利技術(shù)提供了上述分子標(biāo)記在鑒定水稻果皮顏色中的應(yīng)用。本專利技術(shù)提供了上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。本專利技術(shù)提供了用于檢測水稻果皮顏色基因Pb的特異性引物組合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。其中，SEQ ID NO.1所示的正向引物PbF:AGCGACGACGACACCGACG，SEQ ID NO.2所示的反向引物PbR1:ATGCCTGCACCGAGAGGATCCA，和SEQ ID NO.3所示的反向引物PbR2:GTTGATGCCTGCACCGAGAGGACAT。本專利技術(shù)上述引物組合是針對Pb第7外顯子內(nèi)GT片段的缺失設(shè)計、篩選后獲得。PbF在GT缺失位點上游，可以分別與PbR1和PbR2配對擴增，擴增產(chǎn)物大小分別為173bp和179bp。PbR1和PbR2的3’端離GT缺失位點分別為5個堿基和2個堿基，其中PbR1只能與GT缺失基因型完全配對，PbR2只能與野生型基因型完全配對。本專利技術(shù)提供了前述特異性引物組合本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種水稻果皮顏色基因Pb的分子標(biāo)記，其特征在于，通過核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1?3所示的引物擴增得到。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種水稻果皮顏色基因Pb的分子標(biāo)記，其特征在于，通過核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物擴增得到。2.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在鑒定水稻果皮顏色基因Pb基因型中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。4.用于檢測水稻果皮顏色基因Pb的特異性引物組合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。5.權(quán)利要求4所述的特異性引物組合在鑒定水稻果皮顏色基因Pb基因型中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求4所述的特異性引物組合在水稻種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。7.檢測水稻果皮顏色基因Pb基因型的方法，其特征在于，對待測樣本提取基因組DNA后，利用SEQ ID NO.1所示的正向引物、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的反向引物進行PCR，對PCR擴增產(chǎn)物大小進行分...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃培勁，龍湍，唐杰，李佳林，吳永忠，
申請(專利權(quán))人：海南波蓮水稻基因科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：海南;46
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