用于自動生成遺傳修飾的T細胞的方法技術

本發明專利技術提供了一種用于產生遺傳修飾的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的方法，其包括以下步驟：a)提供包含T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的細胞樣品，b)通過離心制備細胞樣品，c)磁性分離該T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞，d)利用調節劑活化富集的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞，e)遺傳修飾該T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞，f)遺傳修飾的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞在培養室中擴增，g)洗滌培養的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞，其特征在于所有步驟在封閉的和無菌的細胞培養系統中進行。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及修飾的T細胞的自動生成。
技術介紹
目前臨床產生基因修飾的T細胞是一個復雜的過程，其一般開始于獲得患者的外周血單核細胞(PBMC)?，F有方案以白細胞分離步驟為特征，其為了增加的細胞產率而以最初的更麻煩的處理為代價(與較小量的抽血相反)。PBMC常常在用病毒或非病毒載體基因修飾之前進行T細胞富集和激活。然后擴增修飾的T細胞以達到治療所需的細胞數量，在這之后，細胞在回輸前進行最終配制和/或冷凍保存。必須對細胞產物進行多項質量控制檢驗，并必須滿足所有發布的標準和優良制造規范(GMP)指南。迄今為止，利用基因修飾的T細胞的過繼細胞轉移(ACT)主要由通過現有的裝置和基礎設施開發了其用于小規模臨床試驗的生產方法的研究人員實施。這樣的個性化治療是復雜的：該細胞生產方法是費力的，因為它包含許多(開放的)操作步驟(例如，密度梯度細胞加工、基因修飾、洗滌、喂養等等)，其需要來自經歷深度訓練的專業熟練的操作人員的介入。失敗率可能由于生產這些復雜的產物對于清潔室人員的高技能和時間要求而是高的。此外，具有清潔室的專用基礎設施和所有必需的儀器必須到位、合格和是功能性的以確保凈化和無菌的密閉。這些要求將此類臨床制造限制于全世界的數量有限的機構。這反過來限制了運行的次數，和因此限制了可以在任何給定時間服務的患者數目。這種不利的商業分配模式阻礙了投資并因此阻礙了廣泛發展對于需要的患者的有希望的療法(Kaiser AD，Cancer Gene Therapy(2015)，1-7)。因此，在本領域中需要用于生成臨床使用的基因修飾的T細胞的方法，其更穩健且不依賴于操作者的技能。
技術實現思路
通常，難以使生物學過程自動化，特別是在必須將多個過程相結合以產生復雜的產品例如基因修飾的T細胞的時候。因此，令人驚訝地發現，在適合于在封閉的符合GMP的環境(封閉的和無菌的細胞培養系統)中的細胞處理的裝置中實施產生遺傳修飾的T細胞的自動化過程是穩健的并且產生與非自動化過程相比相同的或甚至更高量的適合于臨床應用的遺傳修飾T細胞。本專利技術公開了如何獲得更高的轉導效率和穩健的臨床相關數量的基因修飾T細胞的生產，這是由于自動化固有的較少操作和細胞的更“柔和”的操作。在封閉的符合GMP的系統中可以用例如CliniMACS和相關的管道組(Miltenyi Biotec GmbH,Germany)進行細胞處理。所述CliniMACS提供用于細胞處理應用的靈活的平臺，從而能夠實現不同細胞類型的磁性分離以及細胞處理方案。樣品處理系統的細節也公開于WO2009/072003中。本專利技術的方法包括自動化的細胞制備，T細胞、T細胞亞群或T細胞祖細胞的選擇(分離)，所述細胞的活化，所述細胞的擴增，所述細胞的轉導，和所述細胞的配制(洗滌)，例如，用于隨后臨床使用。附圖說明圖1：來自代表性的自動化T細胞富集的結果。圖2：自動化T細胞活化。圖3：允許基因修飾T細胞的自動化生產的軟件架構的示意圖。圖4A，B，C：基因工程化T細胞的生產過程中培養物振搖的影響。圖5：細胞培養物的密度與施加到培養物的振搖類型的影響之間的關系。圖6：自動化生產運行的在線監控。圖7A，B：手動的相對于自動化的條件的轉導效率。圖8：自動化T細胞生產的穩健性。圖9A，B：在第0天使用振搖條件的自動化生產。圖10：在自動化生產過程中細胞培養物的組成。具體實施方式用于生產基因修飾的T細胞的現有技術包括使用大量的裝置來執行生產基因修飾的T細胞的小步驟。許多步驟需要人工干預，因而增加了錯誤的風險。這里，使用單次使用的封閉的和無菌的管道組和編程的軟件在單個裝置中執行所有步驟，例如，使用CliniMACS令人驚異的是，本專利技術的方法相比于手動過程導致所生產的T細胞的更高轉導效率和該基因修飾T細胞的更高的轉基因表達(圖8)。而且可以在不到2周內穩健地產生大量具有高存活力的T細胞(圖8和6)。與本文公開的本專利技術方法相關的這些優點依賴于整個過程中高度保持的環境(溫度和氣體)，因為細胞并不需要從培養箱移出例如用于取樣(否則其將導致培養物溫度的強降低)，并且由于細胞在管道組中溫和的處理和操作和不存在手動移液和/或使用產生難以控制強度和標準化的剪切力并且對細胞和處理有害的注射器。在一個方面，本專利技術提供了一種用于產生遺傳修飾的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的自動化過程(方法)，其包括以下步驟：a)提供包含T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的細胞樣品；b)通過離心制備該細胞樣品；c)磁性分離該T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；d)使用調節劑活化富集的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；e)遺傳修飾該T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；f)在培養室中擴增該遺傳修飾的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；g)洗滌培養的T細胞，其特征在于，所有的步驟在封閉的和無菌的細胞培養系統中進行。所述T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的磁性分離可通過使用對于該T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞表面上的細胞表面標志物特異性的抗原結合分子進行，例如標志物CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD27、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD95、CD127、CD137、α/βTCR、γ/δTCR、CCR7、PD-1或Lag3。所述調節劑可以選自于激動性抗體、細胞因子、重組共刺激分子和小的藥物抑制劑。優選地，所述調節劑是與珠或納米結構偶聯的抗-CD3和抗-CD28抗體或其片段。更優選地，所述調節劑是納米基質，該納米基質包含：a)活動的聚合物鏈的基質，以及b)與所述活動聚合物鏈的基質連接的抗-CD3和抗-CD28抗體或其片段，其中該納米基質的尺寸是1至500納米。該抗-CD3和抗-CD28抗體或其片段可以連接到相同的或不同的活動聚合物鏈的基質。如果抗-CD3和抗-CD28抗體或其片段連接到不同的活動聚合物鏈的基質，微調該納米基質以刺激T細胞是可能的。該納米基質可以是可生物降解的。此外，如在WO2014/048920A1中所公開的所述小的納米基質的無菌過濾是可能的，其是在符合嚴格的GMP標準的條件下，即在封閉的和無菌的細胞培養系統中，長期的T細胞體外增殖中的一個重要特征。可以通過轉導、轉染或電穿孔進行T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的所述遺傳修飾。優選地，用慢病毒、γ-逆轉錄病毒、α-逆轉錄病毒或腺病毒進行轉導或用核酸(DNA、mRNA、miRNA、反義核苷酸抑制劑(antagomirs)、ODNs)、蛋白質、位點特異性核酸酶(鋅指核酸酶、TALENs、CRISP/R)、自復制RNA病毒(例如馬腦病病毒)或整合缺陷型慢病毒載體進行電穿孔或轉染。更優選地，可通過用慢病毒載體轉導所述細胞進行T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的所述遺傳修飾。可通過向所述培養室添加用于細胞培養增殖的適合的細胞培養基，如TexMACS GMP培養基(Miltenyi Biotec GmbH)，來進行遺傳修飾的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的所述擴增。可以通過振搖條件進行T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的所述活化、遺傳修飾和/或所述擴增。優選地，在T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于產生遺傳修飾的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的方法，其包括以下步驟：a)提供包含T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的細胞樣品；b)通過離心制備該細胞樣品；c)磁性分離該T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；d)使用調節劑活化該富集的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；e)遺傳修飾該T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；f)在培養室中擴增該遺傳修飾的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；g)洗滌該培養的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；其特征在于，所有步驟在封閉的和無菌的細胞培養系統中進行。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.04.24 US 61/983,5431.一種用于產生遺傳修飾的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的方法，其包括以下步驟：a)提供包含T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的細胞樣品；b)通過離心制備該細胞樣品；c)磁性分離該T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；d)使用調節劑活化該富集的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；e)遺傳修飾該T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；f)在培養室中擴增該遺傳修飾的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；g)洗滌該培養的T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞；其特征在于，所有步驟在封閉的和無菌的細胞培養系統中進行。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述調節劑選自于激動性抗體、細胞因子、重組共刺激分子和小的藥物抑制劑。3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述調節劑是與珠或納米結構偶聯的抗-CD3和抗-CD28抗體或其片段。4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述納米結構是納米基質，該納米基質包含：a)活動的聚合物鏈的基質，以及b)連接到所述活動的聚合物鏈的基質的抗-CD3和抗-CD28抗體或其片段，其中該納米基質的尺寸是1至500納米。5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中通過用慢病毒、γ-逆轉錄病毒、α-逆轉錄病毒或腺病毒轉導所述細胞，或通過電穿孔或通過核酸、蛋白質、位點特異性核酸酶、自復制RNA病毒或整合缺陷型慢病毒載體的轉染進行所述T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的遺傳修飾。6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中通過用慢病毒載體轉導所述細胞進行所述T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的遺傳修飾。7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述T細胞、T細胞亞群和/或T細胞祖細胞的磁性分離是通過使用對于T細胞...

【專利技術屬性】
技術研發人員：A·凱澤，M·阿森馬赫爾，I·約翰斯頓，
申請(專利權)人：美天旎生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：德國;DE