一種用于刪除植物中的DNA區的方法。在一些實施方案中，該方法包括用核酸分子轉化植物，其中所述核酸分子編碼與一種或多種組織特異性啟動子，例如花粉特異性啟動子可操作連接的一種或多種鋅指核酸酶(ZFN)。方法包括切除植物中的天然基因。因而，在一些實施方案中，工程化改造識別在天然植物基因側翼的序列的ZFN。在又一些實施方案中，將ZFN在發育階段特異性啟動子的控制下表達，使得例如在相對晚期的發育階段期間在植物中特異性切除核酸序列。包括可用于實施公開的方法的核酸分子和由該方法生成的植物。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
一般而言，本專利技術涉及用于生成轉基因植物的組合物和方法。在某些實施方案中，轉基因植物包含一種或多種感興趣的轉基因。在某些實施方案中，在花粉和/或種子中指導轉基因的切除，使得由本專利技術的轉基因植物生成的花粉和/或種子基本上沒有轉基因。在一些實施方案中，例如，本專利技術的轉基因植物可用于實現感興趣的轉基因在轉基因植物中的生物限制(bioconfinement)。在其它實施方案中，轉基因的切除針對特定表達盒,諸如選擇標志，使得僅自轉基因植物和/或轉基因植物后代除去此表達盒。
技術介紹
許多植物用來自其它物種的基因遺傳轉化以導入期望的性狀，諸如以經由例如改善營養價值質量、提高產量、賦予有害物或疾病抗性、提高干旱和應激耐受性、改善園藝質量諸如色素沉著和生長、和/或賦予除草劑抗性；實現自植物生成工業上有用的化合物和/或材料；和/或實現藥物的生成來改善農業價值。克隆基因對植物細胞的導入和穩定的能育轉基因植物的回收可以用于進行植物的此類修飾，并且已經容許經由遺傳工程(例如作物改良)將期望的感興趣的性狀或質量摻入植物中。在這些方法中，通常將外來DNA導入真核植物細胞的核或質體DNA中，接著分離含有整合入細胞的DNA中的外來DNA的細胞，以生成經穩定轉化的植物細胞。關于使用轉基因植物出現的一項缺點是轉基因逃脫至野生物種和非轉化物種的可能性。這些性狀可以增加異型雜交、持久性、和轉基因對鄰近群體的基因滲入(introgression)的風險。轉基因自遺傳改良(GM)作物的逃脫通常經由基因流動，主要通過異花傳粉發生(Lu(2003)Eviron. Biosafety Res. 2:3-8),但是也可以經由基因滲入發生。Stewart Jr.等(2003)Nat. Reviews Gen. 4:806-17。作物間基因流動會導致對非 GM品種(variety)的污染，影響給定農業系統中轉基因和非轉基因作物品種的策略開發。用轉基因材料對非GM作物的顯著污染由于許多國家對轉基因產品進口的法律限制而在國際貿易中造成困難。若轉基因賦予多種抗性(例如，針對除草劑、有害物和/或疾病)，則作物間基因流動可以引起轉基因在可能潛在地變為自生雜草的雜種中疊加。另外，作物間基因流動會導致轉基因逃脫至雜草似的群體或相關野生物種中，若轉基因經由有性生殖和/或無性繁殖在雜草似的/野生的群體中持續并建立，則這會造成嚴重的雜草問題和其它生態學風險。這在逃脫的基因增強雜草似的/野生的物種的生態學適合度時是一項特別的憂慮。作物轉基因的基因滲入在牽涉幾個連續雜種世代的步驟中發生。基因滲入是一種動態過程，其在轉基因在接受物種的遺傳背景中固定前可能花費多年和多代，并且如此呈現檢測和監測的困難。然而，若選擇是強的和/或群體大小較小，則可以快速發生基因滲入基因的固定。遺傳修飾植物內特定表達盒，尤其是選擇標志表達盒的污染是一項易忘的目的。選擇標志基因通?？股乜剐曰虺輨┠褪苄曰颍强梢园▓蟾婊?即，葡糖醛酸糖苷酶(Graham 等(1989) Plant Cell Tiss. Org. 20 (I) : 35-39)。共轉移入植物的基因組中的選擇標志提供選擇優勢，并且容許鑒定經穩定轉化的轉基因植物?？梢杂糜谵D化植物的功能性選擇標志基因的利用度稍微受到限制。發表的關于轉基因作物植物的科學文獻的綜述揭示了抗生素抗性的最廣泛使用的選擇劑是卡那霉素(由新霉素磷酸轉移酶II型基因編碼(Bevan等(1983)Nature 304:184-187))或潮霉素(由潮霉素磷酸轉移酶基因編碼(Waldron等，Plant Mol. Biol. 5:103-108))，并且除草劑耐受性是草胺勝(phosphinothricin)抗性(由 pat (Wohlleben 等(1988) Gene 70:25-37)或 bar 基因(DeBlock 等(1987), EMBO J. 6 (9) :2513-2518)編碼)。見 Sundar 等(2008) J. PlantPhysiol. 165:1698-1716。鑒于有限數目的選擇標志基因和通常使用這些性狀的亞組，容許切除并再使用轉基因植物內的選擇標志的解決辦法會消除在對同一植物的基因轉移或基因疊加的后續輪次中對其它選擇標志的需要。此外，切除選擇標志的能力可以克服對植物轉錄物組(transcriptome)的無意改變,其通過表達標志物引起(Abdeen等(2009)PlantBiotechnol. J. 7(3):211-218)。 目前用于阻止GM作物與其它物種和品種間的基因流動或使其最小化的策略包括(1)物理分離轉基因作物；(2)轉基因的葉綠體工程化；(3)緩解基因(mitigationgene)及轉基因的共工程化改造；(4)遺傳用途限制技術(genetic use restrictiontechnology, GURT) ； (5) CRE/loxP和FLP/FRT重組酶介導的基因刪除。見例如Lee和Natesan (2006) TRENDS Biotech. 24 (3) : 10914; Lu (2003),見上文；及 Luo 等(2007), PlantBiotech. J. 5:263-74;和(6)大范圍核酸酶介導的基因刪除。見例如美國專利申請No. 11/910, 515 ;和美國專利申請 No. 12/600,902。已經利用CRE、FLP、和R重組酶自植物切除不想要的遺傳物質。Hare和Chua(2002)Nat. Biotech. 20:575-80。Luo等(2007)，見上文報告了花粉和種子特異性“GM基因刪除物(deletor) ”系統，其中使用IoxP FRT融合序列作為CRE或FLP重組酶切除轉基因的識別位點導致轉基因自轉基因煙草植物的花粉或自花粉和種子兩者的刪除。顯示在植物中發揮功能的所有這些位點特異性重組酶系統是整合酶家族的成員。至少部分由于其它重組酶可能需要輔助蛋白和可以對重組效率賦予拓撲學限制的更復雜的識別位點的實情，已經選擇這些系統進行使用。同上文。這些系統具有幾個重大的缺點整合酶型重組酶也可以識別“假序列”，其可以與特定的靶序列高度趨異，并且因此導致不想要的非特異性DNA刪除；并且靶序列的切除留下殘留的識別序列，其可以是后續暴露于重組酶后染色體重排的位點，或者激活基因沉默機制。同上文。此外，這些系統進一步受到限制，因為必須存在功能性重組酶，并且其在親本植物之一中表達，其存在需要花粉和/或種子內刪除的其它策略。盡管有這些限制，CRE/loxP系統被認為是用于優化植物中的基因刪除的最合適的策略。同上文。定制設計的鋅指核酸酶(ZFN)是為了遞送DNA中靶定位點特異性雙鏈斷裂，隨后重組切割末端設計的蛋白質。ZFN組合FokI限制性內切核酸酶的非特異性切割域與鋒指 DNA 結合蛋白。見例如 Huang 等(1996) J. Protein Chem. 15:481-9; Kim 等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3616-20 ; Kim 等(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:1156-60;Kim 等(19本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.01.22 US 61/297,6281.一種用于刪除植物中的DNA區的方法，該方法包括 提供含有基因組DNA的能活植物，該基因組DNA包含所述DNA區；并在含有所述基因組DNA的所述能活植物中導入或表達鋅指核酸酶，其中將所述鋅指核酸酶工程化改造為在識別序列處切割所述基因組DNA ； 其中所述方法導致在識別序列處對所述基因組DNA的切割，而且導致所述基因組DNA的切除，其中所述DNA區不存在于所述基因組DNA。2.通過權利要求I的方法生成的轉基因植物。3.一種用于刪除植物中的DNA區的方法，該方法包括 提供含有基因組DNA的第一能活植物，所述基因組DNA包含所述DNA區及在所述DNA區的3’端側翼的第一識別序列和在5’端側翼的第二識別序列； 提供含有基因組DNA的第二能活植物，所述基因組DNA包含編碼工程化改造為在所述識別序列處切割所述基因組DNA的鋅指核酸酶的DNA; 將所述第一和第二能活植物雜交，使得在所述第一或所述第二能活植物上生成Fl種子；并 種植含有基因組DNA的所得Fl植物，其中所述DNA區不存在于所述基因組DNA。4.權利要求3的方法，其中所述第一識別序列和所述第二識別序列是相同的。5.由權利要求3的方法生成的轉基因植物。6.一種分離的核酸分子，其包含 由鋅指核酸酶識別的第一核酸序列； 感興趣的基因；和 由鋅指核酸酶識別的第二核酸序列，其中所述感興趣的基因側翼有由鋅指核酸酶識別的所述第一和第二核酸序列。7.權利要求6的分離的核酸分子，其進一步包含與所述感興趣的基因可操作連接的啟動子。8.權利要求6的分離的核酸分子，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列側翼有同源序列。9.一種生成轉基因植物的方法，包括 用權利要求I的分離的核酸分子轉化植物細胞或植物組織；并 再生全植物。10.由權利要求9的方法生成的轉基因植物。11.一種分離的核酸分子，其包含 啟動子；和 編碼鋅指核...
【專利技術屬性】
技術研發人員：S拉塞爾，JF佩托里諾，
申請(專利權)人：陶氏益農公司，
類型：
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。