本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種小鼠結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型及其建立方法。包括如下步驟：(1)采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建具有螢火蟲素?zé)晒饷富虻腍CT116細(xì)胞，使其在底物激發(fā)下能夠發(fā)出波長在500～600nm的近紅外光；(2)于小鼠腹腔注射10*5個細(xì)胞/只進行造模；(3)通過活體內(nèi)借助D?luciferin對腫瘤進行定位，實時觀測癌癥發(fā)生過程。本發(fā)明專利技術(shù)優(yōu)點在于：本發(fā)明專利技術(shù)采用靈敏精準(zhǔn)的活體熒光成像系統(tǒng)進行實時評測體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移情況，避免了傳統(tǒng)的通過解剖小鼠來判定模型的建立成功，又更好地及時地觀察疾病病理進展過程。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物
，具體地說，是一種結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型及其建立方法。
技術(shù)介紹
結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國僅次于肺癌、胃癌、肝癌、食管癌，據(jù)全國城鄉(xiāng)主要惡性腫瘤估計分析，結(jié)腸癌新發(fā)病例數(shù)達20萬，死亡人數(shù)達10萬，在美國結(jié)腸癌是第三大常見的腫瘤，2008年估計有149000新發(fā)病例，近50000人死于結(jié)腸癌。目前我國結(jié)、直腸癌的發(fā)病率仍處于逐年上升的過程，每年新發(fā)病病例約增加2％。結(jié)腸癌的標(biāo)化發(fā)病率迅速上升，與1972年比，2000年標(biāo)化發(fā)病率男性增加134％，女性增加135％。由于人類的特殊性以及從倫理方面考慮，在人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移機制及抗轉(zhuǎn)移治療方法的研究上，都需要與人結(jié)腸癌更接近、更理想的動物模型。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程是一個多因素、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)演變過程。目前結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)機制尚未完全查明，腫瘤轉(zhuǎn)移動物模型在腫瘤轉(zhuǎn)移的研究中占有極其重要的地位，因此無論是對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過程和轉(zhuǎn)移相關(guān)機制的研究還是對結(jié)腸癌的臨床防治研究，最終都要依靠適宜的動物模型來進行。目前，常用于建立小鼠結(jié)腸癌模型的方法包括自發(fā)及原位誘發(fā)小鼠結(jié)腸癌模型和移植性小鼠結(jié)腸癌模型，后者根據(jù)移植物分為細(xì)胞移植和組織移植，根據(jù)部位的不同，又可分為皮下移植、肝臟移植和原位移植。一個理想合適的動物模型應(yīng)該可以成功模擬人類從臨床發(fā)病到疾病轉(zhuǎn)移以及最后發(fā)展的各個方面，主要概括為以下標(biāo)準(zhǔn)：1、腫瘤細(xì)胞需要具有活力和轉(zhuǎn)移的潛質(zhì)。2腫瘤細(xì)胞需要能夠達到而且侵及到肝臟組織，最終可以在肝臟生長成為腫瘤結(jié)節(jié)。3、動物模型應(yīng)具有較高的有效性。4、動物模型應(yīng)具有可重復(fù)性。5、動物模型應(yīng)該具有實用性。現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)腸癌小鼠模型要么制備周期長、成瘤均一度差；要么未能完全模擬自然轉(zhuǎn)移過程、并發(fā)癥多；要么制備操作復(fù)雜、成功率較低、模型不穩(wěn)定。由于小鼠腸壁菲薄纖細(xì)，注射針極易刺穿腸壁，致使結(jié)腸壁原位注射手術(shù)難度較大，或者因為刺穿腸壁，導(dǎo)致腫瘤接種失敗，或者由于漏液造成腸外腹腔多處種植。即使成功致瘤，也易于出現(xiàn)因接種部位腫瘤組織呈團塊狀生長過大，造成腸腔梗阻，導(dǎo)致小鼠死亡。本專利技術(shù)采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建具有螢火蟲素?zé)晒饷富虻腍CT116細(xì)胞，使其在底物激發(fā)下能夠發(fā)出波長在500～600nm的近紅外光。通過活體內(nèi)借助D-luciferin對腫瘤進行定位，實時觀測癌癥發(fā)生過程。本專利技術(shù)采用靈敏精準(zhǔn)的活體熒光成像系統(tǒng)進行實時評測體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移情況，避免了傳統(tǒng)的通過解剖小鼠來判定模型的建立成功，又更好地及時地觀察疾病病理進展過程。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型的建立方法。本專利技術(shù)的再一的目的是，提供由如上所述方法制備的小鼠結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型。本專利技術(shù)的另一的目的是，提供如上所述小鼠結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型的鑒定方法。為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案是：一種結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型的建立方法，包括如下步驟：(1)采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建具有螢火蟲素?zé)晒饷富虻腍CT116細(xì)胞，使其在底物激發(fā)下能夠發(fā)出波長在500～600nm的近紅外光；(2)取步驟1制備的HCT116細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞株，于小鼠腹腔注射10*5個細(xì)胞/只進行造模；(3)通過活體內(nèi)借助D-luciferin對腫瘤進行定位，實時觀測癌癥發(fā)生過程。一種結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型的建立方法，包括如下步驟：(1)采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建具有螢火蟲素?zé)晒饷富虻腍CT116細(xì)胞，使其在底物激發(fā)下能夠發(fā)出波長在500～600nm的近紅外光；(2)取步驟1制備的HCT116細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞株，2*105個細(xì)胞/只Matrigel基質(zhì)膠固定于于小鼠盲腸壁漿膜層；(3)通過活體內(nèi)借助D-luciferin對腫瘤進行定位，實時觀測癌癥發(fā)生過程。為實現(xiàn)上述第二個目的，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案是：如上任一所述的方法制備的小鼠結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型。為實現(xiàn)上述第三個目的，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案是：如上所述小鼠結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型的鑒定方法，包括如下步驟：(1)分別于3、11、16、22天活體熒光成像檢測腫瘤的形成和發(fā)展；(2)腸系膜成像檢測腹膜轉(zhuǎn)移情況；(3)提取腹水瘤細(xì)胞，培養(yǎng)觀察是否形成細(xì)胞球；(4)蘇木精-伊紅染色檢查模型小鼠大網(wǎng)膜內(nèi)新生血管及血管充血情況；(5)蘇木精-伊紅染色檢查模型小鼠腸系膜壞死組織及粘膜缺損情況。本專利技術(shù)優(yōu)點在于：1、本專利技術(shù)采用靈敏精準(zhǔn)的活體熒光成像系統(tǒng)進行實時評測體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移情況，避免了傳統(tǒng)的通過解剖小鼠來判定模型的建立成功，又更好地及時地觀察疾病病理進展過程。2、本專利技術(shù)采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建具有螢火蟲素?zé)晒饷富虻腍CT116細(xì)胞，使其在底物激發(fā)下能夠發(fā)出波長在500～600nm的近紅外光。我們通過活體內(nèi)借助D-luciferin對腫瘤進行定位，實時觀測癌癥發(fā)生過程。附圖說明附圖1為腹腔注射接種腹膜轉(zhuǎn)移模型，活體熒光成像檢測腫瘤的形成和發(fā)展。附圖2為造模21天后，小鼠腸系膜成像(左，造模組；中，造模組；右，空白組)。附圖3為腹腔注射建立腹膜轉(zhuǎn)移模型，腹水瘤細(xì)胞提取收集培養(yǎng)。附圖4為腹腔注射建立腹膜轉(zhuǎn)移模型，小鼠大網(wǎng)膜切片H&E染色結(jié)果(A為空白對照組，B、C、D分別為3只腹膜轉(zhuǎn)移模型實驗組)。附圖5為腹腔注射建立腹膜轉(zhuǎn)移模型，小鼠腸系膜組織切片H&E染色(E為空白對照組，F(xiàn)、G、H分別為3只腹膜轉(zhuǎn)移模型實驗組)。附圖6為盲腸壁接種腹膜轉(zhuǎn)移模型，活體熒光成像檢測腫瘤的形成和發(fā)展。附圖7為盲腸壁接種10*5個細(xì)胞/只進行造模，造模21天后小鼠腸系膜成像(左，造模組；右，造模組)。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式，進一步闡述本專利技術(shù)。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本專利技術(shù)而不用于限制本專利技術(shù)的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本專利技術(shù)記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本專利技術(shù)作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1腹腔注射結(jié)直腸癌細(xì)胞株建立腹膜轉(zhuǎn)移模型1、動物模型(1)腹腔注射，2*105個細(xì)胞/只2、活體熒光成像腹腔注射接種腹膜轉(zhuǎn)移模型的建立，利用活體熒光成像檢測腫瘤的形成和發(fā)展。結(jié)果如圖1所示，隨著造模時間延長，小鼠體內(nèi)腹腔形成了活體成像儀可檢測到的一定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞。3、開腹成像腹腔注射10*5個細(xì)胞/只進行造模。造模21天后，處死小鼠，腸系膜成像。結(jié)果如圖2所示。可看到小鼠腸系膜轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯，并見明顯腹水，上述結(jié)果表明：腹腔注射造模22天后發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)有明顯的腹膜轉(zhuǎn)移情況。4、腹水收集腹腔注射建立腹膜轉(zhuǎn)移模型，腹水瘤細(xì)胞提取收集培養(yǎng)。實驗結(jié)果如圖3所示，水瘤細(xì)胞提取收集后，進行2D培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)極易形成細(xì)胞球。5、H&E染色腹腔注射癌細(xì)胞方法建立模型下，大網(wǎng)膜切片H&E染色。實驗結(jié)果如圖4所示，相較于空白組，模型組大網(wǎng)膜內(nèi)多處出現(xiàn)明顯的新生血管及血管充血現(xiàn)象。腹腔注射癌細(xì)胞建立模型方法下，腸系膜組織切片H&E染色。實驗結(jié)果如圖5所示，相較于空白組，模型組在腸系膜內(nèi)出現(xiàn)紅染無結(jié)構(gòu)的壞死組織即粘膜及粘膜下層缺損，以及明顯的炎癥細(xì)胞浸潤的情況。實施例2盲腸壁原位接種進行腹膜轉(zhuǎn)移模型的建立1、動物模型盲腸壁原位接種：2*105個細(xì)胞/只Matrigel基質(zhì)膠固定于于盲腸壁漿膜層。2、活體熒光成像盲腸壁接種腹膜轉(zhuǎn)移模型本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建具有螢火蟲素?zé)晒饷富虻腍CT116細(xì)胞，使其在底物激發(fā)下能夠發(fā)出波長在500～600nm的近紅外光；(2)取步驟1制備的HCT116細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞株，于小鼠腹腔注射10*5個細(xì)胞/只進行造模；(3)通過活體內(nèi)借助D?luciferin對腫瘤進行定位，實時觀測癌癥發(fā)生過程。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建具有螢火蟲素?zé)晒饷富虻腍CT116細(xì)胞，使其在底物激發(fā)下能夠發(fā)出波長在500～600nm的近紅外光；(2)取步驟1制備的HCT116細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞株，于小鼠腹腔注射10*5個細(xì)胞/只進行造模；(3)通過活體內(nèi)借助D-luciferin對腫瘤進行定位，實時觀測癌癥發(fā)生過程。2.一種結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建具有螢火蟲素?zé)晒饷富虻腍CT116細(xì)胞，使其在底物激發(fā)下能夠發(fā)出波長在500～600nm的近紅外光；(2)取步驟1制備的HCT116...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔡國響，徐燁，蔡三軍，孟獻珂，鄭洪途，李清國，
申請(專利權(quán))人：復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31
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