CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法技術

本發明專利技術提供一種CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法，通過根據GenBank?CXCR4的mRNA全序列，經BLAST同源性比對證實特異性后應用RNA?structure?4.4軟件對靶mRNA序列的二級結構進行評估，得到19nt靶序列；然后針對各靶序列設計合成其相應的兩條shRNA寡核苷酸單鏈；然后環狀空質粒酶切后，酶切片段連接PLVX.1載體與shRNA寡核苷酸雙鏈，連接形成的重組載體，連接產物轉化新鮮感受態細胞E.coli?DH5α，37℃培養16h后挑陽性克隆進行菌落PCR鑒定，測序結果驗證重組質粒構建成功后，提取重組質粒。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程領域，具體涉及一種CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法。
技術介紹
當前在世界范圍內肺癌發病率逐年上升，每年大約有超過一百萬人死于肺癌，已成為惡性腫瘤最常見死因之一，肺癌約30%患者在病程中出現顱腦轉移，腦轉移瘤自然生存時間為1～3個月，是惡性腫瘤嚴重并發癥之一，顱腦轉移為肺癌死亡的重要原因之一。趨化因子是一類具有生物化學趨化性的細胞因子，其中SDF-1及其特異性受體 CXCR4在腫瘤細胞的遷移與侵襲中發揮了重要的作用。研究顯示 SDF-1及其受體CXCR4組成的信號傳導通路可能與肺癌的發生、發展及顱腦轉移關系密切。在非小細胞肺癌早期診斷和治療中，侵襲和轉移是非小細胞肺癌治療效果不佳的主要因素。為了更好的研究CXCR4/SDF-1生物學軸在非小細胞肺癌侵襲及轉移特別是腦轉移中的作用，本研究采用具有腦轉移潛能的肺癌細胞PC-9構建細胞模型，通過設計針對CXCR4基因序列的shRNA片段，構建慢病毒shRNA干擾表達載體，從而特異性的靶向沉默肺癌細胞CXCR4基因的表達。慢病毒介導的shRNA干擾的特點是高效、穩定且靜默持續時間長，為進一步研究SDF-1/CXCR4生物學軸在非小細胞肺癌顱腦轉移中的作用提供了工具。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法。為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：CXCR4RNAi慢病毒載體，所述載體含有CXCR4基因片段。CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法，包括如下：（1）干擾序列設計：根據GenBank CXCR4的mRNA全序列，經BLAST同源性比對證實特異性后應用RNA structure 4.4軟件對靶mRNA序列的二級結構進行評估，得到19nt靶序列；然后針對各靶序列設計合成其相應的兩條shRNA寡核苷酸單鏈；同時設計一對對照序列siRNAc；（2）慢病毒表達載體的構建及鑒定：空載體pGC-LV 帶有 GFP標記，將PLVX-shRNA-PURO vector環狀空質粒用BamH 和EcoR 限制性內切酶進行雙酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段，連接空PLVX.1載體（來自clontech公司）與shRNA寡核苷酸雙鏈，連接形成的重組載體，連接產物轉化新鮮感受態細胞E.coli DH5α，37℃培養16h后挑陽性克隆進行菌落PCR鑒定，測序結果驗證重組質粒構建成功后，提取重組質粒；（3）QPCR篩選shRNA：CXCR4基因的QPCR引物為載體多克隆位點兩端的引物，培養293細胞，將質粒和lipo2000復合物加入六孔板293細胞中，提取各組細胞的RNA，將RNA反轉錄為cDNA，利用cDNA為模板，利用所述QPCR引物檢測CXCR4基因的相對表達量，熒光定量檢測各組引物；PCR反應條件：95℃30s，1循環，55℃30s40循環，95℃5s，60℃1min，95℃15s。步驟（3）中所述QPCR引物序列為： Primer（＋）:5’GGAGAGTTGTAGGATTCTAC-3’，Primer(-):5’-CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG-3’。PLVX-shRNA-PURO vector環狀空質粒是由clontech公司載體PLVX-shRNA2改造的，具體方式是:擴增puro表達框，將puro表達框克隆至PLVX-shRNA2載體ZSgreen后面。公認的綠色強熒光蛋白，本領域技術人員可以按此方法獲得該質粒。本專利技術的優點在于：慢病毒載體和逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體等相比，具有以下的優點：（1）可感染分裂期細胞與非分裂期細胞，如神經系統、造血系統等非分裂期細胞，免疫反應較小；（2）可轉移基因片段較大，可插入約10 kb 的基因片段；（3）病毒突變與產生有復制能力的病毒機率較小，大大減少了產生有復制能力的病毒（replication competent virus，RCV）；（4）目的基因和宿主基因組通過整合，可實現目的基因較長時間的表達。基因治療中的RNA干擾技術已成為腫瘤治療的新方法，慢病毒載體能安全將腫瘤目的基因轉移到機體。通過慢病毒載體介導的RNAi技術，發現與疾病相關的影響因素，并嘗試由此著手研究治療的方法，達到治療疾病的效果。為此還應該保證更高的安全性、 有效性和可靠性，并逐步從體外實驗和動物實驗進入到臨床試驗階段，相信該技術將在今后的研究領域和臨床實際應用方面有著更廣闊的前景。附圖說明圖1 CXCR4-shRNA陽性克隆PCR鑒定圖，1：陰性對照（ddH2O）；2:Marker；3-8:CXCR4-shRNA克隆。圖2各組293細胞中CXCR4表達變化（,n=3），*P < 0.01,**P =0.192 >0.05)。具體實施方式 1材料與方法1.1材料人肺腺癌PC9細胞株購自上海玉博生物科技有限公司。細胞用DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10%培養基，在37℃，5％CO2的細胞培養箱中常規培養。CXCR4兔多克隆抗體、GAPDH鼠多抗購自abcam公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自abcam公司1.2方法1.2.1 干擾序列設計根據GenBank CXCR4的mRNA全序列（Accession No：NM_003467），經BLAST同源性比對證實特異性后應用RNA structure 4.4軟件對靶mRNA序列的二級結構進行評估，得到3條19nt靶序列。然后針對各靶序列設計合成其相應的兩條shRNA寡核苷酸單鏈。同時設計一對對照序列siRNAc。然后根據siRNA的序列設計合成兩條shRNA寡核苷酸單鏈。設計如下：BamH 酶切位點+19 nt靶核苷酸序列+莖環結構（TTCAAGAGA）+靶序列互補序列+RNA Poly聚合酶轉錄中止位點（TTTTTT）+EcoR 酶切位點六個區域，分別命名為shRNA1、shRNA2 、shRNA3、，以及shRNAc，具體序列見表1。shRNA寡核苷酸鏈由上海生工公司合成。表1. CXCR4基因的3條特異性SiRNA靶序列1.2.2 慢病毒表達載體的構建及鑒定空載體pGC-LV 帶有 GFP標記。將PLVX-shRNA-PURO vector環狀空質粒用BamH 和EcoR 限制性內切酶進行雙酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段。連接空PLVX.1載體與shRNA寡核苷酸雙鏈，連接形成的重組載體分別標記為：PLVX-CXCR4shRNA1、PLVX-CXCR4shRNA2、PLVX-CXCR4shRNA3、PLVX-CXCR4shRNAc。連接產物轉化新鮮感受態細胞E.coli DH5α。37℃培養16h后挑陽性克隆進行菌落PCR鑒定，送上海生工進行DNA測序鑒定。測序結果驗證重組質粒構建成功后，提取重組質粒。1.2.3 QPCR篩選最佳干擾效果的shRNACXCR4基因的QPCR引物為載體多克隆位點兩端的引物，序列為Primer（＋）:5,’GGAGAGTTGTAGGATTCTAC3’，Primer(-):5’CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG3’，培養293細胞，將質粒(pLVX-CXC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法，其特征在于：所述構建方法包括如下：（1）干擾序列設計：根據GenBank?CXCR4的mRNA全序列，經BLAST同源性比對證實特異性后應用RNA?structure?4.4軟件對靶mRNA序列的二級結構進行評估，得到19nt靶序列；然后針對各靶序列設計合成其相應的兩條shRNA寡核苷酸單鏈；（2）慢病毒表達載體的構建及鑒定：空載體pGC?LV?帶有?GFP標記，將PLVX?shRNA?PURO?vector環狀空質粒，用BamH和EcoR限制性內切酶進行雙酶切，并回收PLVX?SHRNA?PURO?vector酶切片段，連接空PLVX.1載體與shRNA寡核苷酸雙鏈，連接形成的重組載體，連接產物轉化新鮮感受態細胞E.coli?DH5α，37℃培養16h后挑陽性克隆進行菌落PCR鑒定，測序結果驗證重組質粒構建成功后，提取重組質粒pLVX?CXCR4shRNA；（3）QPCR篩選shRNA：CXCR4基因的QPCR引物為載體多克隆位點兩端的引物，培養293細胞，將獲得的質粒pLVX?CXCR4shRNA和lipo2000復合物加入六孔板293細胞中，提取各組細胞的RNA，將RNA反轉錄為cDNA，利用cDNA為模板，利用所述QPCR引物檢測CXCR4基因的相對表達量，熒光定量檢測各組引物；PCR反應條件：95℃30s，1循環，55℃30s40循環，95℃5s，60℃1min，95℃15s。...

【技術特征摘要】
1.CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法，其特征在于：所述構建方法包括如下：（1）干擾序列設計：根據GenBank CXCR4的mRNA全序列，經BLAST同源性比對證實特異性后應用RNA structure 4.4軟件對靶mRNA序列的二級結構進行評估，得到19nt靶序列；然后針對各靶序列設計合成其相應的兩條shRNA寡核苷酸單鏈；（2）慢病毒表達載體的構建及鑒定：空載體pGC-LV 帶有 GFP標記，將PLVX-shRNA-PURO vector環狀空質粒，用BamH和EcoR 限制性內切酶進行雙酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段，連接空PLVX.1載體與shRNA寡核苷酸雙鏈，連接形成的重組載體，連接產物轉化新鮮感受態細胞E.coli DH5α，37℃培養16h后挑陽性克隆進行菌落PCR鑒定，測序結果驗證重組質粒構建成功后，提取重組質粒pLVX-CXCR4shRNA；（3）QPCR篩選shRNA：CXCR4基因的QP...

【專利技術屬性】
技術研發人員：胡志堅，陳愉生，李鴻茹，鐘雪晶，
申請(專利權)人：福建醫科大學，
類型：發明
國別省市：福建;35