本發明專利技術公開了一種用于檢測七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙及其應用，該試紙包括有底座、襯板、試紙芯和覆蓋試紙芯的面板，試紙芯包括樣品墊、帶有金標抗體的膠體金結合墊、硝酸纖維素反應膜和吸水墊；膠體金結合墊包被有膠體金標記的七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白；硝酸纖維素膜上設有檢測線和對照線，檢測線和對照線上分別包被的是七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白和鼠抗神經壞死病毒MCP重組蛋白單克隆抗體，本發明專利技術提供了用于檢測七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的MCP重組蛋白的核苷酸序列。本發明專利技術的試紙操作簡便、靈敏度高、結果快速、成本低廉，適合養殖場開展七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的快速診斷。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于水產動物免疫學檢測
，具體涉及一種用于檢測七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙及其應用。
技術介紹
七帶石斑魚（Epinephelus septemfasciatus Thunberg，1793）是我國沿海分布緯度最高的石斑魚種類，除了具有個體大、生長速度快和經濟價值高等特點外，對低溫的耐受能力較強，生存水溫9~34℃，攝食水溫12~32℃，有“冷水石斑”之稱，被認為是東北亞溫帶海域網箱養殖理想海水魚類品種之一，其苗種繁育技術的突破，可以緩解我國東海北部和黃渤海沿岸網箱適養魚類品種缺乏的問題，因此備受業界重視。但是盡管國內外研究多年，七帶石斑魚的苗種繁育技術始終不能穩定，在所面臨的技術瓶頸中，神病毒性神經壞死病(viral nervousnecrosis，VNN)造成的早期苗種死亡率居高不下是目前最亟待解決的關鍵問題。病毒性神經壞死病(viral nervousnecrosis，VNN)是目前全球范圍內除非洲外海水養殖魚類危害最嚴重的病毒性疾病之一，分為SJNNV、TPNNV，BFNNV和RGNVV4種類型，已報道的感染養殖魚類種類已超過13科近40種。養殖石斑魚受害尤其嚴重，受到感染后，早期仔稚魚死亡率高達100%，中間培育稚魚死亡率也常常超過50%，即便是體重超過1.5kg的養殖成魚受到感染后也會死亡。因此，VNN已經成為造成養殖石斑魚從苗種到養殖大量死亡的主要原因之一。我國是石斑魚養殖大國，2008年產量達到4.5萬t，占世界石斑魚養殖總產量7.5萬t的一半以上，為保障我國石斑魚養殖這一海水養殖支柱產業的可持續穩定發展，亟需對石斑魚病毒性神經壞死病的防治技術開展深入研究。病毒性神經壞死病（viral nervousnecrosis，VNN）是由諾達病毒科（Nodaviridae）的一種小RNA病毒引起的，該病毒被稱為神經壞死病病毒（nervousnecrosis virus，NNV），NNV的傳播主要有兩條途徑，一是由攜帶病毒的親魚通過配子垂直傳播給子代，另外一條途徑是同一養殖環境中養殖魚群體間、不同種類養殖魚類或者棲息生物間以及從生鮮餌料魚和生物餌料至養殖群體的水平傳播。為了明晰NNV的傳播途徑和研發出相應的預防技術，目前國內外研究學者已經開發出了多種NNV檢測技術，如原位雜交、免疫組織化學方法、熒光抗體技術、細胞培養、ELISA、逆轉錄轉錄酶鏈式聚合反應（RT-PCR）和實時定量PCR等方法。目前在生產實際中較為有效的檢測手段均建立在神經壞死病毒外殼蛋白基因核苷酸序列的PCR擴增基礎之上，但仍然存在檢測成本高、操作繁瑣、周期長、需要專用儀器設備等缺點，無法滿足養殖現場大規模快速準確檢測的需求。膠體金免疫層析技術則是在膠體金標記技術和免疫層析技術發展的基礎上，結合了單克隆抗體技術和新材料技術，它以膠體金為標記物，利用特異性抗原抗體反應，在層析反應過程中，通過帶顏色的膠體金顆粒來放大免疫反應系統，使反應結果在固相載體上直接顯示出來。該技術操作簡便、可靠性好、靈敏度高、反應迅速、結果直觀并可大量制備，成本低廉，適合養殖場的大批量快速檢測，真正實現了長期以來人們在檢測
所追求的“快速、簡便、特異、敏感”的目標。膠體金免疫層析技術已在豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒等多種動物病毒檢測中得到應用，研究技術成熟，但現尚未見有將膠體金免疫層析技術用于石斑魚神經壞死病毒抗體檢測的相關報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對石斑魚神經壞死病毒檢測，提供了一種用于檢測七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙及其應用。本專利技術的檢測試紙操作簡便、靈敏度高、結果快速、成本低廉，適合養殖場開展七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的快速診斷。為實現上述專利技術目的，本專利技術采用以下技術方案予以實現：本專利技術提供了一種用于檢測七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的MCP重組蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示。本專利技術還提供了一種用于檢測七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙，所述檢測試紙包括有底座、襯板、試紙芯和覆蓋于試紙芯上的面板，襯板連接在底座之上，所述試紙芯安裝在襯板內，所述面板上設有加樣孔和結果顯示窗，所述試紙芯包括樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素反應膜和吸水墊，依次粘貼于襯板上；所述加樣孔設于樣品墊的上方位置，所述結果顯示窗設于硝酸纖維素反應膜上方對應的位置，所述硝酸纖維素膜上設有檢測線和對照線，檢測線上包被有七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白，對照線上包被有鼠抗七帶石斑魚神經壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體，所述的膠體金結合墊為包被有膠體金標記的七帶石斑魚MCP重組蛋白的玻璃纖維紙。進一步的：所述七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白的包被量為1.0 ~ 10μg蛋白，所述膠體金標記的七帶石斑魚MCP重組蛋白中膠體金標記量為1~20μg/mL，所述鼠抗七帶石斑魚神經壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體的包被量為0.5 ~5.0μg 蛋白。進一步的：所述檢測線和對照線兩者線間距為5-7 mm。進一步的：所述的七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白采用以下方法制備得到：(1) 七帶石斑魚神經壞死病毒MCP蛋白重組表達質粒的構建以七帶石斑魚神經壞死病毒RNA 為模板，設計引物克隆得到編碼七帶石斑魚神經壞死病毒MCP蛋白的cDNA 序列，將該序列插入表達載體，獲得重組表達載體；(2) 七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白在大腸桿菌中的表達將重組表達載體轉化大腸桿菌，挑選含重組表達載體的大腸桿菌接種到培養基中進行擴大培養，然后加入IPTG 誘導表達，收集細菌培養物；(3) 七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組包涵體蛋白的變復性收集包涵體，包涵體用緩沖液稀釋后，裝入透析袋中進行透析；(4) 七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白的Ni柱親和純化；將透析后的包涵體溶液上樣至親和層析柱進行蛋白純化，收集蛋白流出液；將其裝入透析袋中進行透析，獲得純化的MCP重組蛋白。進一步的：所述步驟(1) 中引物序列為：正向引物(F):Forward 5’-CCGGAATTCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3’；反向引物(R)：Forward 5’-CCGCTCGAGGTTTTCCGAGTCAACCCTAGTG-3’。進一步的：所述步驟(2)中當細菌濃度生長到OD600=0.5~1.0時，按濃度0.5 ~ 0.7mmol/L 加入IPTG 誘導3 ~5h，離心，收集細菌培養物。進一步的：所述膠體金標記的七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白采用以下方法制備得到：采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，取膠體金溶液和七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白，攪拌震蕩使其結合，加入牛血清白蛋白，離心，棄上清，沉淀加入金標緩沖溶液懸浮后定容制得。本專利技術還提供了膠體金免疫層析檢測試紙在制備用于檢測七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的檢測用品中的應用。進一步的：在加樣孔內加入稀釋后的魚類待檢血清樣本，靜置后如果若檢測線和對照線均呈現紅色，表明待檢血清樣本中含有神經壞死病毒抗體；如果只有對照線呈現紅色，表明檢測樣品中不含有神經壞死病毒抗體。與現有技術相比，本專利技術的優點和技術效果是：本專利技術提供的檢測試紙包括有底座本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于檢測七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的MCP重組蛋白的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3?所示。
【技術特征摘要】
1.一種用于檢測七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的MCP重組蛋白的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示。2.一種用于檢測七帶石斑魚神經壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙，其特征在于：所述檢測試紙包括有底座、襯板、試紙芯和覆蓋于試紙芯上的面板，襯板連接在底座之上，所述試紙芯安裝在襯板內，所述面板上設有加樣孔和結果顯示窗，所述試紙芯包括樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素反應膜和吸水墊，依次粘貼于襯板上；所述加樣孔設于樣品墊的上方位置，所述結果顯示窗設于硝酸纖維素反應膜上方對應的位置，所述硝酸纖維素膜上設有檢測線和對照線，檢測線上包被有七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白，對照線上包被有鼠抗七帶石斑魚神經壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體，所述的膠體金結合墊為包被有膠體金標記的七帶石斑魚MCP重組蛋白的玻璃纖維紙。3.根據權利要求2所述的膠體金免疫層析檢測試紙，其特征在于：所述七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白的包被量為1.0 ~ 10μg蛋白，所述膠體金標記的七帶石斑魚MCP重組蛋白中膠體金標記量為1~20μg/mL，所述鼠抗七帶石斑魚神經壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體的包被量為0.5 ~5.0μg 蛋白。4.根據權利要求2 所述的膠體金免疫層析檢測試紙，其特征在于：所述檢測線和對照線兩者線間距為5-7 mm。5.根據權利要求2 所述的膠體金免疫層析檢測試紙，其特征在于：所述的七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白采用以下方法制備得到：(1) 七帶石斑魚神經壞死病毒MCP蛋白重組表達質粒的構建以七帶石斑魚神經壞死病毒RNA 為模板，設計引物克隆得到編碼七帶石斑魚神經壞死病毒MCP蛋白的cDNA 序列，將該序列插入表達載體，獲得重組表達載體；(2) 七帶石斑魚神經壞死病毒MCP重組蛋白在大腸桿菌中的表達將重組表達載體轉化大腸桿菌，挑選含重組表達載體的大腸...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉濱，劉新富，孟振，柳學周，
申請(專利權)人：中國水產科學研究院黃海水產研究所，
類型：發明
國別省市：山東;37
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