一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條。該試紙條包括：樣品吸收墊、含有膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白單克隆抗體的玻璃纖維膜、有檢測線T和對照線C的硝酸纖維素膜、吸水濾紙和底板；檢測線T包被有豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體，對照線C包被有二抗IgG；樣品吸收墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次相互搭接粘貼于底板上。本發(fā)明專利技術(shù)利用膜層析雙抗體夾心法檢測樣本中豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其操作簡單、方便、快捷，不需要特殊儀器設(shè)備和專業(yè)培訓(xùn)，易于推廣，結(jié)果清晰易辨，適合基層，適合突發(fā)事件的大批量現(xiàn)場檢測和流行病學(xué)調(diào)查，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染診斷起到輔助作用。

Test paper for rapid detection of colloidal gold of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

The invention discloses a colloidal gold rapid detection test paper strip for porcine reproductive and respiratory syndrome virus. The test strip includes: porcine reproductive and respiratory absorption pad, containing colloidal gold labeled synthetic glass fiber membrane, protein M syndrome virus monoclonal antibody detection line T and nitrocellulose membrane, the control line C absorbent filter and the bottom plate; detection line T coated with porcine reproductive and respiratory syndrome virus protein synthesis GP5 monoclonal antibody, C control line is coated with two anti IgG; sample absorption pad, glass fiber membrane, nitrocellulose membrane and absorbent filter are pasted on the bottom plate overlap. The invention uses membrane chromatography samples double antibody sandwich method in porcine reproductive and respiratory syndrome virus, its operation is simple and convenient, do not need special equipment and professional training, easy popularization, the clear, suitable for mass detection and epidemiological investigation, the scene for emergencies, to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection diagnosis play a supporting role.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條
本專利技術(shù)屬于動物病毒性疾病監(jiān)測和診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條。
技術(shù)介紹
豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）俗稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的一種以母豬繁殖障礙、仔豬出現(xiàn)呼吸道疾病為特征的傳染病。是世界動物衛(wèi)生組織（OfficeInternationalDesEpizooties，OIE）列入的93種法定報告的動物疫病之一。據(jù)統(tǒng)計，該病每年給美國的養(yǎng)豬業(yè)造成近5.6億美元的經(jīng)濟損失（ChoandDee,2006）。我國于1996年從流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSV，證實我國也存在豬繁殖與呼吸綜合征。隨著病毒的遺傳和變異，2006年，我國又爆發(fā)了以變異美洲型病毒為病原的高致病性豬藍耳病（TianKetal.,2007），使我國養(yǎng)豬業(yè)蒙受了巨大的經(jīng)濟損失。目前檢測PPRSV的方法主要有RT-PCR法、病毒分離鑒定、免疫組化法、間接免疫熒光試驗和血清中和試驗等診斷方法，但這些方法要么需要操作活病毒，要么操作復(fù)雜、耗時長，要么特異性和敏感性不足，不利于基層的應(yīng)用和推廣。病毒檢測方法：1、血清學(xué)試驗血清學(xué)方法是目前廣泛應(yīng)用于實驗室的檢測方法。目前國內(nèi)外已經(jīng)建立了4種檢測PRRS抗體的方法。1）免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）IPMA是廣泛應(yīng)用于該病診斷的一種方法，敏感性和特異性都比較好，可用于PRRSV抗原的檢測，病毒鑒定及血清抗體檢測。目前該方法在歐美等國家已經(jīng)廣泛應(yīng)用于PRRSV感染的研究中。試驗主要在Marc-145培養(yǎng)物上進行。IPMA能在感染后6天血清中檢測到PRRSV抗體，具有較高的特異性。2）間接熒光抗體試驗（IFA)免疫熒光抗體染色技術(shù)是應(yīng)用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，建立了免疫熒光抗體技術(shù)用于直接檢測仔豬肺組織中的抗原。有的直接采集小豬的肺泡巨噬細(xì)胞進行直接培養(yǎng)，用病毒特異性熒光抗體進行檢測。3）血清中和試驗（SN）SN檢測PRRSV抗體雖然特異性良好，但PRRSV的SN抗體比IFA抗體在血清中出現(xiàn)的晚，對急性感染的敏感性差，因此SN不適合做早期診斷，而且細(xì)胞培養(yǎng)工作量大、技術(shù)性強，目前僅適于實驗室研究用。作為經(jīng)典方法在病毒鑒定中起著重要的作用，許多新的檢測方法都要以此作為標(biāo)準(zhǔn)進行比較。4）間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（間接ELISA)ELISA靈敏度高，特異性好，制好的診斷膜片常溫下保存時間長，攜帶寄送方便，操作簡便，快速，不需要特殊實驗條件，反應(yīng)板可重復(fù)使用多次，結(jié)果客觀，肉眼易于判斷。2、分子生物學(xué)診斷技術(shù)利用RT-PCR、核酸探針、序列測定和原味雜交等方法對PRRSV進行分子診斷和分型，從分子水平揭示抗原變異的基礎(chǔ)和毒種演化過程。RT-PCR擴增病毒基因組的通用引物分別針對歐美毒株的特異性引物進行分型鑒定。嵌套性RT-PCR中同時使用通用引物和特異性引物在一次PCR反應(yīng)中即可進行分型診斷。膠體金免疫層析法（ImmunochromatographyAssay）始于上世紀(jì)90年代中期，是在免疫滲濾法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它是免疫親和技術(shù)、印記技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)和層析技術(shù)的結(jié)合。將包被抗原、將包被抗原、膠體金標(biāo)記抗體固相化，與樣本吸附材料等組合在一起，制備為免疫層析診斷試紙條，使用時只需要將試紙條插入樣本溶液，數(shù)分鐘就可以判斷結(jié)果。與免疫滲濾法比較，穩(wěn)定性好，操作更簡便、快速，且由于試紙條形式，無需低溫保存，儲運方便。針對豬藍耳病的流行現(xiàn)狀和防治要求，對于豬藍耳病的診斷，不但要求高的特異性和敏感性，還需要快速、簡便、易于基層醫(yī)療和衛(wèi)生單位使用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的首要目的在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條，該試紙條使用方便、快捷，可檢測豬標(biāo)本中豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原，用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的輔助診斷。本專利技術(shù)的另一目的在于提供上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條的制備方法。本專利技術(shù)的再一目的在于提供上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條的應(yīng)用。本專利技術(shù)的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條，包含：樣品吸收墊（玻璃纖維膜）、含有膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白單克隆抗體的玻璃纖維膜、依次有檢測線T和對照線C兩條帶的硝酸纖維素膜、吸水濾紙和底板；所述的檢測線T包被有豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體，對照線C包被有二抗IgG；樣品吸收墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次相互搭接粘貼于底板上。所述的二抗IgG優(yōu)選為抗鼠IgG抗體。所述的玻璃纖維膜中膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白單克隆抗體的標(biāo)記pH優(yōu)選為7.4-7.8，膠體金和M蛋白單克隆抗體的配比優(yōu)選為15-20μg/mL膠體金。所述的硝酸纖維素膜中豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體包被濃度優(yōu)選為1.0mg/mL，包被量1-5μL/cm；二抗IgG包被濃度優(yōu)選為1.5mg/mL，包被量1-5μL/cm。上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：將膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白單克隆抗體噴涂于玻璃纖維膜上；將豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白的單克隆抗體包被于硝酸纖維素膜檢測線T處，將二抗IgG包被于硝酸纖維素膜對照線C處；在底板上依次相互搭接粘貼樣品吸收墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙。優(yōu)選的，上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：（1）制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白單克隆抗體和豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體。（2）硝酸纖維膜的制備：將豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白的單克隆抗體稀釋成1.0mg/mL，將二抗IgG稀釋成1.5mg/mL，均以1-5μL/cm的量噴于硝酸纖維膜上，形成檢測線T和對照線C，干燥后備用。（3）玻璃纖維膜的制備：將膠體金的pH調(diào)整為7.4-7.8，膠體金和豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白單克隆抗體的配比為15-20μg/mL膠體金，經(jīng)穩(wěn)定劑處理后，噴涂于玻璃纖維膜上，冷凍干燥，備用。（4）在底板上依次相互搭接粘貼樣品吸收墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙。本專利技術(shù)所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條可用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒。其使用方法包括如下步驟：將待檢樣品滴在樣品吸收墊處，5-10min判定結(jié)果，對比檢測線T和對照線C的顏色，檢測線T和對照線C同時出現(xiàn)紅色，為陽性反應(yīng)（說明待檢樣品中含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒）；對照線C出現(xiàn)紅色，檢測線無顏色變化，為陰性反應(yīng)（說明血清中無豬繁殖與呼吸綜合征病毒或豬繁殖與呼吸綜合征病毒量不足）；對照線無顏色變化，則說明試紙條失效。本專利技術(shù)采用豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體和抗鼠IgG分別固相于硝酸纖維膜上，結(jié)合膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白單克隆抗體，應(yīng)用膜層析雙抗體夾心法原理檢測標(biāo)本中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原。應(yīng)用本專利技術(shù)試紙條檢測，操作簡單、方便、快速、簡捷，不需要特殊本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條，其特征在于包含：樣品吸收墊、含有膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白單克隆抗體的玻璃纖維膜、依次有檢測線T和對照線C兩條帶的硝酸纖維素膜、吸水濾紙和底板；所述的檢測線T包被有豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體，對照線C包被有二抗IgG；樣品吸收墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次相互搭接粘貼于底板上；制備所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白單克隆抗體與豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體的M蛋白與GP5蛋白通過包括如下步驟的方法制備得到：(1)用如下引物分別擴增M蛋白基因片段和GP5蛋白基因片段：M蛋白基因上游引物：5’?GTAGGTACCACCATGGGGTCGTCCTTAGATGACTTC?3’，M蛋白基因下游引物：5’?GACCTCGAGCCGTTGTTATTTGGCATATT?3’；GP5蛋白基因上游引物：5’?CTCGAGATGTTGGGGAAGTGCTTGACC?3’，GP5蛋白基因下游引物：5’?GGTACCCTAGAGACCCCATCGTTC?3’；(2)PCR擴增產(chǎn)物電泳后分別切膠回收，分別與pMD?18T克隆載體16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆37℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，以質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定陽性克隆，送測序；(3)用限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI酶切分別連接有M基因和GP5基因的pMD?18T載體和PET?32a(+)，1％瓊脂糖電泳切膠回收M基因和GP5基因目的片段和PET?32a(+)雙酶切后的大片段，用T4DNA連接酶分別將二者連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)8～10小時，分別挑取單菌落培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，用PCR及限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI雙酶切分別鑒定，PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳進行分析，篩選陽性克隆，將重組質(zhì)粒送出測序；(4)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21中，并進行誘導(dǎo)表達得到M蛋白和GP5蛋白；(5)使用含有HIS標(biāo)簽的親和層析柱子純化融合蛋白。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金快速檢測試紙條，其特征在于包含：樣品吸收墊、含有膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白單克隆抗體的玻璃纖維膜、依次有檢測線T和對照線C兩條帶的硝酸纖維素膜、吸水濾紙和底板；所述的檢測線T包被有豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體，對照線C包被有二抗IgG；樣品吸收墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次相互搭接粘貼于底板上；制備所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白單克隆抗體與豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體的M蛋白與GP5蛋白通過包括如下步驟的方法制備得到：(1)用如下引物分別擴增M蛋白基因片段和GP5蛋白基因片段：M蛋白基因上游引物：5’-GTAGGTACCACCATGGGGTCGTCCTTAGATGACTTC-3’，M蛋白基因下游引物：5’-GACCTCGAGCCGTTGTTATTTGGCATATT-3’；GP5蛋白基因上游引物：5’-CTCGAGATGTTGGGGAAGTGCTTGACC-3’，GP5蛋白基因下游引物：5’-GGTACCCTAGAGACCCCATCGTTC-3’；(2)PCR擴增產(chǎn)物電泳后分別切膠回收，分別與pMD-18T克隆載體16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆37℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，以質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定陽性克隆，送測序；(3)用限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI酶切分別連接有M基因和GP5基因的pMD-18T載體和PET-32a(+)，1％瓊脂糖電泳切膠回收M基因和GP5基因目的片段和PET-32a(+)雙酶切后的大片段，用T4DNA連接酶分別將二者連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)8～10小時，分別挑取單菌落培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，用PCR及限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI雙酶切分別鑒定，PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳進行分析，篩選陽性克隆，將重組質(zhì)粒送出測序；(4)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21中，并進行誘導(dǎo)表達得到M蛋白和GP5蛋白；(5)使...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李建，漆世華，謝紅玲，溫文生，韓興，舒銀輝，廖園園，劉潔，秦紅剛，徐松，牟林琳，朱薇，馮釗，
申請(專利權(quán))人：武漢中博生物股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：湖北,42