鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒、其制備及使用方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)領(lǐng)域，具體提供一種鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒，包括襯板，所述襯板的上表面依次搭接設(shè)置有樣品墊、結(jié)合墊、NC膜以及吸收墊，所述NC膜上設(shè)置有檢測(cè)線和質(zhì)控線，NC膜的檢測(cè)線處包被第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體，所述NC膜的質(zhì)控線包被羊抗雞IgY多抗抗體；所述結(jié)合墊處設(shè)置有第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球和雞IgY標(biāo)記的熒光微球。相應(yīng)的，本發(fā)明專利技術(shù)還提供了所述蛋白定量檢測(cè)試劑盒的制備及使用方法。本發(fā)明專利技術(shù)結(jié)合熒光免疫層析技術(shù)和時(shí)間分辨免疫熒光理論，進(jìn)行鐵蛋白檢測(cè)時(shí)具有操作簡(jiǎn)便、能夠?qū)崿F(xiàn)即時(shí)檢測(cè)、并且靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)一次加樣，10min讀取測(cè)試結(jié)果，靈敏度可達(dá)2.5ng/ml。

Ferritin quantitative detection kit, preparation and use method thereof

The invention belongs to the technical field of medical and health, a ferritin quantitative detection kit specifically provides, including lining plate, are lapped surface of the lining board is provided with a sample pad, combination pad, NC membrane and the absorbent pad, the NC film is arranged on the test line and control line, detection of NC film package by second mouse anti ferritin monoclonal antibody, quality control line of the NC film coated with Goat anti chicken IgY polyclonal antibody; combined with fluorescent microspheres with fluorescent microspheres first mouse anti ferritin labeled monoclonal antibody and IgY labeled chicken at the pad set. Accordingly, the invention also provides the preparation and the use method of the protein quantitative detection kit. The method combines the fluorescence immunity chromatography technique and the time resolved immunofluorescence theory to detect the ferritin, and has the advantages of simple operation, immediate detection, high sensitivity and good specificity. To achieve a sampling, 10min read the test results, sensitivity of up to 2.5ng/ml.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒、其制備及使用方法
本專利技術(shù)屬于醫(yī)療衛(wèi)生
，具體涉及一種鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒、其制備及使用方法。
技術(shù)介紹
目前基于膠體金法或第一代熒光法的檢測(cè)試劑，在定量檢測(cè)精密度和準(zhǔn)確性以及操作便利性方面還存在嚴(yán)重的缺陷。第一代熒光檢測(cè)法的鐵蛋白試劑大部分都是利用普通的熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。普通的熒光物質(zhì)Stokes位移小，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊，相互干擾，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；普通熒光物質(zhì)的熒光壽命非常短，激發(fā)光消失，熒光也消失。而且在生物流體和血清中的許多復(fù)合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光，對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。1942年Wissman發(fā)現(xiàn)，某些β-二酮與銪配合后可吸收紫外光，發(fā)出強(qiáng)烈的銪離子的特征熒光。1979年，芬蘭SoiniHemmia提出時(shí)間分辨熒光免疫分析理論；2003年，上海新波生物技術(shù)有限公司應(yīng)用該技術(shù)推出了首個(gè)體外診斷產(chǎn)品。目前，也有少數(shù)公司利用時(shí)間分辨免疫分析理論，做出了鐵蛋白定量檢測(cè)試劑，但是，這些鐵蛋白定量檢測(cè)試劑均需要加樣、孵育、洗滌等步驟，操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，而且需要專業(yè)人士操作，還不能做到即時(shí)檢測(cè)。綜上，為了解決傳統(tǒng)鐵蛋白檢測(cè)存在的易受本底熒光干擾、靈敏度低、特異性差、操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)并且不能做到即時(shí)檢測(cè)等不足，一種新的鐵蛋白定量檢測(cè)技術(shù)亟待開發(fā)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本專利技術(shù)提供了一種操作簡(jiǎn)便、能夠?qū)崿F(xiàn)即時(shí)檢測(cè)、并且靈敏度高、特異性好的鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒。本專利技術(shù)還相應(yīng)提供了所述鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，所述制備方法能夠進(jìn)一步提升所制得的鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)鐵蛋白的靈敏度和特異性。同時(shí)，本專利技術(shù)還相應(yīng)的提供了所述鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒的使用方法，該使用方法能夠消除試劑盒的本底熒光干擾，進(jìn)一步提升檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和特異性。本專利技術(shù)的設(shè)計(jì)思路：非常少的稀土金屬(Eu、Tb、Sm、Dy)的熒光壽命較長(zhǎng)，可達(dá)1～2ms，能夠滿足測(cè)量要求，因此而產(chǎn)生了時(shí)間分辨熒光分析法，即使用長(zhǎng)效熒光標(biāo)記物，在關(guān)閉激發(fā)光后再測(cè)定熒光強(qiáng)度的分析方法。鑭系元素的熒光光譜有較大的Stokes位移，最大可達(dá)290nm，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜間不會(huì)相互重疊，加上其發(fā)射的光譜信號(hào)峰很窄，熒光壽命長(zhǎng)，銪的熒光壽命可達(dá)730μs，檢測(cè)中只要在每個(gè)激發(fā)光脈沖過后采用延緩測(cè)量時(shí)間的方式，待短壽命的背景熒光衰變消失后，再打開取樣門儀器記錄長(zhǎng)壽命銪鰲合物發(fā)射的特異性熒光，可以避免本底熒光干擾，提高檢測(cè)的精密度。本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案為：本專利技術(shù)首先提供一種鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒，包括襯板，所述襯板的上表面依次搭接設(shè)置有樣品墊、結(jié)合墊、NC膜以及吸收墊，所述NC膜上設(shè)置有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述NC膜的檢測(cè)線處包被第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體，所述NC膜的質(zhì)控線包被羊抗雞IgY多抗抗體；所述結(jié)合墊處設(shè)置有第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球和雞IgY標(biāo)記的熒光微球。相應(yīng)的，本專利技術(shù)還提供了前述本專利技術(shù)的鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，該制備方法中“將各個(gè)預(yù)制好的部件按照結(jié)構(gòu)要求組裝在一起”的具體方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)行業(yè)通用知識(shí)可以輕松實(shí)現(xiàn)的，并且該部分并不是本專利技術(shù)的創(chuàng)新點(diǎn)所在，因此不再詳細(xì)贅述。本專利技術(shù)的制備方法中，結(jié)合墊以及NC膜的包被是至關(guān)重要的。結(jié)合墊中的所述第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球通過以下步驟制備：S1、取熒光微球并用硼酸緩沖液稀釋，獲得熒光微球稀釋液；S2、向所得熒光微球稀釋液內(nèi)加入EDC溶液進(jìn)行活化，獲得熒光微球活化液；S3、將所得熒光微球活化液離心，去除上清液，取下層沉淀；S4、向下層沉淀內(nèi)加入硼酸緩沖液進(jìn)行復(fù)溶，然后加入第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體的稀釋液，搖床反應(yīng)，即得到第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球溶液。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，進(jìn)一步的特征優(yōu)化，結(jié)合墊中的所述第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球通過以下具體步驟制備實(shí)現(xiàn)：s1、取熒光微球并用50mmol/L的硼酸緩沖液稀釋10倍，得到熒光微球稀釋液；s2、每1000μL熒光微球稀釋液內(nèi)加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃條件下以80rpm/min旋轉(zhuǎn)搖床，搖勻活化15min，獲得熒光微球活化液；s3、將所得熒光微球活化液在4～10℃條件下，以14000rpm/min離心10min，去除上清液，取下層沉淀；s4、向下層沉淀內(nèi)加入硼酸緩沖液進(jìn)行復(fù)溶，然后加入第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體的稀釋液得到標(biāo)記反應(yīng)體系，并使第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體在標(biāo)記反應(yīng)體系中的濃度為25μg/ml；將標(biāo)記反應(yīng)體系置于搖床，4℃條件下以80rpm/min搖勻1h，再繼續(xù)搖床標(biāo)記反應(yīng)1h，即得到第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球溶液。結(jié)合墊中的所述雞IgY標(biāo)記的熒光微球通過以下步驟制備：P1、取熒光微球并用硼酸緩沖液稀釋，獲得熒光微球稀釋液；P2、向所得熒光微球稀釋液內(nèi)加入EDC溶液進(jìn)行活化，獲得熒光微球活化液；P3、將所得熒光微球活化液離心，去除上清液，取下層沉淀；P4、向下層沉淀內(nèi)加入硼酸緩沖液進(jìn)行復(fù)溶，然后加入雞IgY的稀釋液，搖床反應(yīng)，即得到雞IgY標(biāo)記的熒光微球溶液。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，進(jìn)一步的特征優(yōu)化，結(jié)合墊中的所述雞IgY標(biāo)記的熒光微球通過以下具體步驟制備實(shí)現(xiàn)：p1、取熒光微球并用50mmol/L的硼酸緩沖液稀釋10倍，得到熒光微球稀釋液；p2、每1000μL熒光微球稀釋液內(nèi)加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃條件下以80rpm/min旋轉(zhuǎn)搖床，搖勻活化15min，獲得熒光微球活化液；p3、將所得熒光微球活化液在4～10℃條件下，以14000rpm/min離心10min，去除上清液，取下層沉淀；p4、向下層沉淀內(nèi)加入硼酸緩沖液進(jìn)行復(fù)溶，然后加入雞IgY的稀釋液得到標(biāo)記反應(yīng)體系，并使雞IgY在標(biāo)記反應(yīng)體系中的濃度為25μg/ml；將標(biāo)記反應(yīng)體系置于搖床，4℃條件下以80rpm/min搖勻1h，再繼續(xù)搖床標(biāo)記反應(yīng)1h，即得到雞IgY標(biāo)記的熒光微球溶液。第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球和雞IgY標(biāo)記的熒光微球分別制備獲取后，即可將兩者混合用于結(jié)合墊的制備，具體過程步驟為：將所得第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球溶液和雞IgY標(biāo)記的熒光微球溶液混合得混合液，將混合液在乳膠墊上噴膜得到微球乳膠結(jié)合墊，將微球乳膠結(jié)合墊在37℃條件下烘干24h后即得所述結(jié)合墊。根據(jù)本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例，所述NC膜的制備方法為：向10mmol/L的PBS緩沖液中加入5wt％的蔗糖得到包被稀釋液，使用所述包被稀釋液分別稀釋第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體和羊抗雞IgY多抗抗體得到第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體稀釋液和羊抗雞IgY多抗抗體稀釋液，然后使用第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體稀釋液和羊抗雞IgY多抗抗體稀釋液分別在硝酸纖維素膜上的T線和C線處劃線，依次分別形成包被第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體的檢測(cè)線和包被羊抗雞IgY多抗抗體的質(zhì)控線，然后將硝酸纖維素膜在37℃條件下干燥4～6h即得所述NC膜。出于消除本底熒光，降低本底干擾的角度考慮，本專利技術(shù)還提供了前述本專利技術(shù)的鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括如下步驟：將待測(cè)樣品置于樣品墊，待測(cè)樣品由樣品墊向吸收墊層析，待測(cè)樣品經(jīng)過結(jié)合墊進(jìn)入NC膜的檢測(cè)線和質(zhì)控線進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒，包括襯板(5)，所述襯板(5)的上表面依次搭接設(shè)置有樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、NC膜(3)以及吸收墊(4)，所述NC膜(3)上設(shè)置有檢測(cè)線和質(zhì)控線，其特征在于：所述NC膜(3)的檢測(cè)線處包被第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體，所述NC膜(3)的質(zhì)控線包被羊抗雞IgY多抗抗體；所述結(jié)合墊(2)處設(shè)置有第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球和雞IgY標(biāo)記的熒光微球。

【技術(shù)特征摘要】
1.鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒，包括襯板(5)，所述襯板(5)的上表面依次搭接設(shè)置有樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、NC膜(3)以及吸收墊(4)，所述NC膜(3)上設(shè)置有檢測(cè)線和質(zhì)控線，其特征在于：所述NC膜(3)的檢測(cè)線處包被第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體，所述NC膜(3)的質(zhì)控線包被羊抗雞IgY多抗抗體；所述結(jié)合墊(2)處設(shè)置有第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球和雞IgY標(biāo)記的熒光微球。2.一種權(quán)利要求1所述的鐵蛋白定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球通過以下步驟制備：S1、取熒光微球并用硼酸緩沖液稀釋，獲得熒光微球稀釋液；S2、向所得熒光微球稀釋液內(nèi)加入EDC溶液進(jìn)行活化，獲得熒光微球活化液；S3、將所得熒光微球活化液離心，去除上清液，取下層沉淀；S4、向下層沉淀內(nèi)加入硼酸緩沖液進(jìn)行復(fù)溶，然后加入第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體的稀釋液，搖床反應(yīng)，即得到第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球具體制備步驟如下：s1、取熒光微球并用50mmol/L的硼酸緩沖液稀釋10倍，得到熒光微球稀釋液；s2、每1000μL熒光微球稀釋液內(nèi)加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃條件下以80rpm/min旋轉(zhuǎn)搖床，搖勻活化15min，獲得熒光微球活化液；s3、將所得熒光微球活化液在4～10℃條件下，以14000rpm/min離心10min，去除上清液，取下層沉淀；s4、向下層沉淀內(nèi)加入硼酸緩沖液進(jìn)行復(fù)溶，然后加入第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體的稀釋液得到標(biāo)記反應(yīng)體系，并使第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體在標(biāo)記反應(yīng)體系中的濃度為25μg/ml；將標(biāo)記反應(yīng)體系置于搖床，4℃條件下以80rpm/min搖勻1h，再繼續(xù)搖床標(biāo)記反應(yīng)1h，即得到第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，所述雞IgY標(biāo)記的熒光微球通過以下步驟制備：P1、取熒光微球并用硼酸緩沖液稀釋，獲得熒光微球稀釋液；P2、向所得熒光微球稀釋液內(nèi)加入EDC溶液進(jìn)行活化，獲得熒光微球活化液；P3、將所得熒光微球活化液離心，去除上清液，取下層沉淀；P4、向下層沉淀內(nèi)加入硼酸緩沖液進(jìn)行復(fù)溶，然后加入...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張海峰，劉圍，王春華，楊雯雯，馬啟冠，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：山東愛維德生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東,37