本發明專利技術涉及基因工程領域，公開了一種PSG3標準品、其制備方法以及用于制備的重組菌。將表達重組PSG3的重組菌進行發酵和誘導，后直接收集菌體破碎后沉淀提取總蛋白；然后采用兩步純化法后得到該制劑的純品，向純品中加入凍干保護劑進行真空冷凍干燥后得到標準品。目前國際國內均沒有重組PSG3的標準品，本發明專利技術為建立重組PSG3蛋白質量標準奠定了基礎，利用本發明專利技術方法制備的PSG3經SDS-PAGE鑒定其純度為98%，相對分子量46kD；HPLC鑒定其純度為99.32%。此外，本發明專利技術制得的重組PSG3的標準品為凍干制劑，2～8℃可長期保存，在低于25℃室溫下可保存兩年。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程領域，具體涉及一種重組妊娠特異性糖蛋白3標準品、其制備方法以及用于制備的重組菌。
技術介紹
妊娠特異性糖蛋白（PregnancySpecificGlycoprotein,PSG）是一種胎盤多肽，自1971年德國科學家Bohn從人胎盤中分離提純以來，各國學者對其進行了廣泛的研究。發現PSG與早孕并發癥、宮內胎兒生長狀況及消化道腫瘤疾病關系密切，對臨床上相關疾病的診斷具有指示作用。日本學者報道妊娠特異性糖蛋白1（PregnancySpecificGlycoprotein1，PSG1）可在子宮頸癌、子宮體癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤和和胃腸道惡性腫瘤患者的血中測出，進一步研究證實癌細胞漿中存在有PSG1的患者比沒有PSG1患者存活時間短。近年來對妊娠特異性糖蛋白3（PregnancySpecificGlycoprotein3，PSG3）的研究受到廣泛關注。PSG3是癌胚抗原(CEA)家族的成員，PSG3蛋白全長428個氨基酸，在胚胎發育的過程中同胚胎期免疫耐受的建立以及血管生成有關，同時該指標可應用于消化道腫瘤的診斷。對于生物制品來說，其質量評價的有效性指標多采用生物學方法，這些方法本身變異性較大，因此，標準品是生產中必不可少的組成部分，在生物制品標準化、質量控制和效力評價中，標準品是藥品質量評價的標尺，起著非常重要的作用。但實驗室現有的PSG3檢測試劑無標準品。而天然PSG3抗原在胎盤中含量又低、來源有限且純化過程較為繁瑣因此建立一種經濟、高效的基因工程方法制備PSG3標準品蛋白就顯得尤為重要。專利
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種制備PSG3標準品的重組菌及方法。本專利技術是通過以下技術方案實現的：一種制備妊娠特異性糖蛋白3標準品的方法，包括如下步驟：（1）構建重組菌：將妊娠特異性糖蛋白3的編碼基因連接入基因的表達載體中，并將構建好的基因表達載體導入宿主大腸桿菌菌體中，構建重組菌；其中，編碼妊娠特異性糖蛋白3的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。（2）重組菌發酵誘導培養：將重組菌用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷進行發酵誘導培養，得到發酵液；（3）蛋白純化：將誘導后菌體破碎，取沉淀；經蛋白純化即可得重組妊娠特異性糖蛋白3純化后蛋白溶液；（4）蛋白標準品的獲得：向重組妊娠特異性糖蛋白3純化后蛋白溶液中加入凍干保護劑，經真空冷凍干燥，即可制得重組妊娠特異性糖蛋白3標準品。本專利技術所述的方法，步驟（1）所述基因的表達載體為pET-30α。本專利技術所述的方法，步驟（1）所述宿主大腸桿菌為E.coliJM109(DE3)。本專利技術所述的方法，步驟（2）所述發酵誘導培養使用含標記物的LB培養基進行克隆培養。本專利技術所述的方法，所述標記物為卡那青霉素。本專利技術所述的方法，步驟（3）所述蛋白純化包括變復性純化、陰離子交換層析純化步驟。利用權利要求1至6任一所述的方法制備的標準品，所述妊娠特異性糖蛋白3的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。一種用于制備妊娠特異性糖蛋白3標準品的重組菌，所述重組菌是將妊娠特異性糖蛋白3的編碼基因連接入基因的表達載體中，并將構建好的基因表達載體導入宿主大腸桿菌菌體中得到的，且所述重組菌的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。本專利技術所述的重組菌，所述基因的表達載體為pET-30α。本專利技術所述的重組菌，所述宿主大腸桿菌為E.coliJM109(DE3)。本專利技術的有益效果在于：目前國際國內均沒有重組PSG3的標準品，本專利技術提供一種重組PSG3蛋白生物學活性檢測用標準品的制備方法，為建立重組PSG3蛋白質量標準奠定基礎；SDS-PAGE鑒定其純度為98%，相對分子量46kD，HPLC鑒定其純度為99.32%；此外，本專利技術制得的重組PSG3的標準品為凍干制劑，2～8℃可長期保存，在低于25℃室溫下可保存兩年。附圖說明圖1為本專利技術重組PSG3的SDS-PAGE檢測結果圖：其中，泳道M：蛋白Marker；泳道1：純化后重組PSG3蛋白；圖2為本專利技術重組PSG3的HPLCC18反相層析C蛋白純度檢測結果圖。具體實施方式為更好理解本專利技術，下面結合實施例及附圖對本專利技術作進一步描述，以下實施例僅是對本專利技術進行說明而非對其加以限定。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。1.構建重組菌：將PSG3的編碼基因連接入基因的表達載體pET-30α中，并將構建好的基因表達載體pET-30α-PSG3導入宿主大腸桿菌E.coliJM109(DE3)菌體中，構建重組菌JM109(DE3)/pET-30α-PSG3；其中，編碼PSG3的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，PSG3的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，重組菌的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。2.PSG3蛋白溶液的制備(2-1)將重組PSG3工程菌接種到含有卡那青霉素的LB固體培養基上，37℃恒溫培養12~24h，挑取克隆接種于3-5ml的LB培養基中，37℃恒溫搖床培養至OD600達到1.5~1.8，轉速為220r/min；(2-2將(2-1)獲得的菌液1:100接種到100-200ml的LB培養基中，37℃恒溫搖床培養至OD600達到1.5~1.8，轉速為220r/min，得到發酵種子液；(2-3)將配好的LB培養基加到發酵罐中，連接pH探針、溶氧探針進行原位滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時間為20min；(2-4)將發酵種子液1:100接種于發酵罐中LB培養基上，設置溫度為37℃、溶氧為30%、轉速為220~270r/min、pH為7.2~7.4條件下發酵；當發酵罐內的OD600達到1.0~1.2時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為1mmol/L，調溫度至32℃，誘導表達4~5h，得到發酵液；(2-5)將發酵液4℃條件下6000r/min離心10min，收集菌體，用適量的0.1M磷酸鹽緩沖液重懸菌體，在800bar壓力下高壓均質破碎，重復破碎2-3次，4℃條件下12000r/min離心10~15min，收集沉淀；重復離心一次，收集沉淀，即可得到重組PSG3蛋白粗品。3.PSG3蛋白溶液的純化3.1變復性純化將收集的PSG3蛋白用洗滌Buffer（50mM三羥甲基氨基甲烷，2M尿素，100mM氯化鈉，1mM乙二胺四乙酸，pH8.5）洗滌兩次，每次洗滌時間為2-3h，洗滌完12000r/min離心15min，收集沉淀。再將沉淀用溶解Buffer（50mM三羥甲基氨基甲烷，8M尿素，100mM氯化鈉，1mM乙二胺四乙酸，pH8.5）溶解，溶解完用透析Buffer（50mM三羥甲基氨基甲烷，4-0M尿素，100mM氯化鈉，1mM乙二胺四乙酸，pH8.5）透析，尿素濃度依次為4M、3M、2M、1M、0M每個尿素濃度的透析Buffer本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種制備妊娠特異性糖蛋白3標準品的方法，其特征在于，包括如下步驟：（1）構建重組菌：將妊娠特異性糖蛋白3的編碼基因連接入基因的表達載體中，并將構建好的基因表達載體導入宿主大腸桿菌菌體中，構建重組菌；其中，編碼妊娠特異性糖蛋白3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；（2）重組菌發酵誘導培養：將重組菌用異丙基?β?D?硫代吡喃半乳糖苷進行發酵誘導培養，得到發酵液；（3）蛋白純化：將誘導后菌體破碎，取沉淀；經蛋白純化即可得重組妊娠特異性糖蛋白3純化后蛋白溶液；（4）蛋白標準品的獲得：向重組妊娠特異性糖蛋白3純化后蛋白溶液中加入凍干保護劑，經真空冷凍干燥，即可制得重組妊娠特異性糖蛋白3標準品。
【技術特征摘要】
1.一種制備妊娠特異性糖蛋白3標準品的方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）構建重組菌：將妊娠特異性糖蛋白3的編碼基因連接入基因的表達載體中，并將構建好的基因表達載體導入宿主大腸桿菌菌體中，構建重組菌；其中，編碼妊娠特異性糖蛋白3的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
（2）重組菌發酵誘導培養：將重組菌用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷進行發酵誘導培養，得到發酵液；
（3）蛋白純化：將誘導后菌體破碎，取沉淀；經蛋白純化即可得重組妊娠特異性糖蛋白3純化后蛋白溶液；
（4）蛋白標準品的獲得：向重組妊娠特異性糖蛋白3純化后蛋白溶液中加入凍干保護劑，經真空冷凍干燥，即可制得重組妊娠特異性糖蛋白3標準品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）所述基因的表達載體為pET-30α。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）所述宿主大腸桿菌為E.coliJM109(DE3)。
4.根據權利要...
【專利技術屬性】
技術研發人員：程書鈞，趙俊，王明麗，肖汀，馮林，
申請(專利權)人：中國醫學科學院腫瘤醫院，必歐瀚生物技術合肥有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。