基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)的轉(zhuǎn)基因水稻TT51?1檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)的轉(zhuǎn)基因水稻TT51?1檢測(cè)方法，首先針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻TT51?1轉(zhuǎn)化事件3’端基因的部分區(qū)域設(shè)計(jì)一套LAMP引物組合，包括TT51?1?F3/B3和TT51?1?FIP/BIP(Seq?ID?No:1?4)，在所述引物組合基礎(chǔ)上結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51?1轉(zhuǎn)化事件。本方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，結(jié)果易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因水稻TT51?1檢測(cè)提供了有效、快速的檢測(cè)方法，非常適于基層檢測(cè)使用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及植物分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)的轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
轉(zhuǎn)基因水稻TT51中轉(zhuǎn)入的外源基因是Cryab基因，包括兩個(gè)衍生轉(zhuǎn)化體華恢1號(hào)和Bt汕優(yōu)63。華恢1號(hào)是由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的高抗鱗翅目害蟲(chóng)的水稻品種，其受體品種是常規(guī)秈稻-水稻三系恢復(fù)系明恢63，外源基因是具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的殺蟲(chóng)蛋白融合基因cry1Ab/cry1Ac。該外源基因表達(dá)的蛋白可以專一、高效的控制二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等水稻鱗翅目害蟲(chóng)。經(jīng)過(guò)多代選擇，獲得的能夠穩(wěn)定遺傳表達(dá)的恢復(fù)系即華恢1號(hào)。Bt汕優(yōu)63是以華恢1號(hào)為父本、珍汕97A為母本獲得的雜交水稻品系。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedisothermalamplificationmethod,LAMP)是Notomi等，于2000年專利技術(shù)的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4-6條特異性引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在等溫條件下(60-65℃)反應(yīng)，在1h內(nèi)即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，目的片段可以擴(kuò)增109倍。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增效率高、省時(shí)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在核酸檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。目前環(huán)介導(dǎo)等溫檢測(cè)技術(shù)的產(chǎn)物檢測(cè)方法主要有濁度法、染料法、電泳法以及核酸試紙條，但是這些方法都容易引起交叉污染。核酶是一種具有類過(guò)氧化物酶活性、富含鳥(niǎo)嘌呤的單鏈DNA分子，在特定的條件下能夠折疊成G4重結(jié)構(gòu)，在H2O2存在下能夠催化無(wú)色底物2,2′-連氮基-雙-(3-乙基并二氫噻唑啉-6-磺酸)二價(jià)陰離子(ABTS2-)氧化成藍(lán)綠色物質(zhì)ABTS-·自由基。當(dāng)存在單鏈DNA分子的互補(bǔ)鏈時(shí)，這種類過(guò)氧化物酶的活性降低甚至消失。將折中顯色/消光技術(shù)結(jié)合到環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)上，利用引物顯色，產(chǎn)物消光的手段，來(lái)驗(yàn)證目的片段的存在。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一套用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的LAMP引物組合以及含有該引物組合的試劑盒。本專利技術(shù)的另一目的是提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)的轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1檢測(cè)方法。為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)首先提供一套用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的LAMP引物組合，所述引物組合根據(jù)TT51-1的外源基因3’端設(shè)計(jì)，包括(SeqIDNo:1-4)：外側(cè)正向引物TT51-1-F3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGCCGGCGTCAATACGGGATA-3’；外側(cè)反向引物TT51-1-B3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGTCGTAGCCCCACCACTAC-3；’以及內(nèi)側(cè)正向引物TT51-1-FIP：5’-CGGTCATTGACTGGAGCGAGGCTGGGAGGGAGGGAGGGATACCGCGCCACATAGCA-3’；內(nèi)側(cè)反向引物TT51-1-BIP：5’-AGAGACTGGTGATTTCAGCGGGCTGGGAGGGAGGGAGGGCTTATCTGCCCCAGCACTC-3’。本專利技術(shù)還提供含有上述LAMP引物組合用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、BstDNA聚合酶、甜菜堿、ABTS顯色液、hemin工作液、H2O2溶液(優(yōu)選30％H2O2溶液)、Thermopol緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板等中的至少一種。其中，所述ABTS顯色液的濃度為36mM，配制溶劑為1×DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。所述hemin工作液的組成如下：50mMhemin、10mMNaH2PO4、100mMKCl、2mMMgCl2和0.003％TritonX-100。本專利技術(shù)中，BstDNA聚合酶凍干在PCR管內(nèi)底部，于-20℃保存。dNTPs、ABTS顯色液、hemin工作液、ABTS粉劑、DMSO緩沖液、30％H2O2可常溫保存。反應(yīng)液需4℃保存。本專利技術(shù)還提供所述LAMP引物組合或所述試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1中的應(yīng)用。本專利技術(shù)進(jìn)一步提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)的轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1檢測(cè)方法，包括以下步驟：1)提取待測(cè)樣品中的DNA；2)顯色反應(yīng)，并通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)混合液的顏色，或利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)混合液在419nm處的OD值：3)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用所述LAMP引物組合，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光反應(yīng)：4)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。步驟1)可采用CTAB法提取待測(cè)樣品中的DNA。步驟2)具體為：將hemin工作液與權(quán)利要求1所述LAMP引物組合混合，35-45℃孵育20-30min，然后添加ABTS顯色液和H2O2，立即用肉眼觀察顏色或利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD419nm值；顯色反應(yīng)的反應(yīng)體系為：40-60μMhemin工作液90μL，10μM引物TT51-1-F3和TT51-1-B3各0.5μL，10μM引物TT51-1-FIP和TT51-1-BIP各3-4μL，30-40mMABTS顯色液30μL，30％H2O21μL，用ddH2O補(bǔ)足至總體系130μL。步驟3)具體為：向步驟2)顯色反應(yīng)所得混合液中添加16μL擴(kuò)增試劑，所述擴(kuò)增試劑包括1.8-3.0mMdNTP、6-9mMMgSO4、1-2M甜菜堿、3.6-10.0UBstDNA聚合酶、1×Thermopol緩沖液和2μLDNA模板，配制反應(yīng)體系，然后60-65℃孵育40-60min，80-85℃放置2-3分鐘，最后冰上終止反應(yīng)。步驟4)具體為：目測(cè)判定反應(yīng)前后反應(yīng)混合液顏色變化，或利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定步驟3)所得反應(yīng)混合液在419nm處的OD值；若顏色由反應(yīng)前的藍(lán)色變成淺藍(lán)色或無(wú)色，或者反應(yīng)后OD419nm值變小，表明待測(cè)樣品中含有轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1成分。本專利技術(shù)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光反應(yīng)在水浴鍋或金屬浴內(nèi)進(jìn)行。本專利技術(shù)通過(guò)對(duì)影響環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的因素(dNTPs、甜菜堿、引物、Mg2+、BstDNA聚合酶、溫度、反應(yīng)時(shí)間等)進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了最佳的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。在本專利技術(shù)的一個(gè)具體實(shí)施方式中，基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)的轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1檢測(cè)方法包括以下步驟：①將樣品磨成粉末，稱100mg±10mg樣品，用CTAB法提取基因組，作為DNA模板(例如將提取的基因組DNA稀釋至50ng/μL作為模板)；②顯色反應(yīng)：將hemin工作液與LAMP引物組合混合，40℃孵育30min，然后添加ABTS顯色液和H2O2，立即用肉眼觀察顏色或利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD419nm值；顯色反應(yīng)的反應(yīng)體系為：50μMhemin工作液90μL，10μM引物TT51-1-F3和TT51-1-B3各0.5μL，10μM引物TT51-1-FIP和TT51-1-BIP各4μL，36mMABTS顯色液30μL，30％H2O21μL，用ddH2O補(bǔ)足至總體系130μL；③環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光反應(yīng)：向步驟②顯色反應(yīng)所得混合液中添加16μL擴(kuò)增試劑，所述擴(kuò)增試劑包括2.5mMdNTP、7.8mMMgSO4、1.6M甜菜堿、8.0UBstDNA聚合酶、1×Thermopol緩沖液和2μLDNA模板，配制反應(yīng)體系，然后65℃孵育40min，85℃放置3分鐘，最后冰上終止反應(yīng)；④目測(cè)判定反應(yīng)前后反應(yīng)混合液顏色變化，或利用紫本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51?1的LAMP引物組合，其特征在于，所述引物組合根據(jù)TT51?1的外源基因3’端設(shè)計(jì)，包括：外側(cè)正向引物TT51?1?F3：5’?CTGGGAGGGAGGGAGGGCCGGCGTCAATACGGGATA?3’；外側(cè)反向引物TT51?1?B3：5’?CTGGGAGGGAGGGAGGGTCGTAGCCCCACCACTAC?3；’以及內(nèi)側(cè)正向引物TT51?1?FIP：5’?CGGTCATTGACTGGAGCGAGGCTGGGAGGGAGGGAGGGATACCGCGCCACATAGCA?3’；內(nèi)側(cè)反向引物TT51?1?BIP：5’?AGAGACTGGTGATTTCAGCGGGCTGGGAGGGAGGGAGGGCTTATCTGCCCCAGCACTC?3’。

【技術(shù)特征摘要】
1.用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的LAMP引物組合，其特征在于，所述引物組合根據(jù)TT51-1的外源基因3’端設(shè)計(jì)，包括：外側(cè)正向引物TT51-1-F3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGCCGGCGTCAATACGGGATA-3’；外側(cè)反向引物TT51-1-B3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGTCGTAGCCCCACCACTAC-3；’以及內(nèi)側(cè)正向引物TT51-1-FIP：5’-CGGTCATTGACTGGAGCGAGGCTGGGAGGGAGGGAGGGATACCGCGCCACATAGCA-3’；內(nèi)側(cè)反向引物TT51-1-BIP：5’-AGAGACTGGTGATTTCAGCGGGCTGGGAGGGAGGGAGGGCTTATCTGCCCCAGCACTC-3’。2.含有權(quán)利要求1所述LAMP引物組合用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的試劑盒。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、BstDNA聚合酶、甜菜堿、ABTS顯色液、hemin工作液、H2O2溶液、Thermopol緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板中的至少一種。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述ABTS顯色液的濃度為36mM，配制溶劑為1×DMSO；所述hemin工作液的組成如下：50μMhemin、10mMNaH2PO4、100mMKCl、2mMMgCl2和0.003％TritonX-100。5.權(quán)利要求1所述LAMP引物組合或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1中的應(yīng)用。6.基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)的轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：1)將樣品磨成粉末，稱100mg±10mg樣品，用CTAB法提取基因組DNA；2)顯色反應(yīng)，并通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)混合液的顏色，或利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)混合液在419nm處的OD值：3)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述LAMP引物組合，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光反應(yīng)：4)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)具體為：將hemin工作液與權(quán)利要求1所述LAMP引物組合混合，35-45℃孵育20-30min，然后添加ABTS顯色液和H2O2，立即用肉眼觀察顏色或利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD419nm值；顯色反應(yīng)的反應(yīng)體系為：40-60μMhemin工作液90μL，10...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃昆侖，許文濤，徐瑗聰，王晨光，羅云波，張莉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11